新型隐球菌感染中宿主与病原体相互作用的深度解析：小鼠模型揭示的关键奥秘

《Infection and Immunity》：The hypervirulent Type-1/Type-17 phenotype of Cryptococcus neoformans clinical isolates is specific to A/J mice

本文通过小鼠模型研究新型隐球菌（Cryptococcus neoformans）感染，发现宿主遗传背景影响感染结局。

　　### 引言
新型隐球菌（Cryptococcus neoformans）是一种机会性真菌病原体，能在免疫功能低下的个体中引发危及生命的隐球菌性脑膜炎。尽管医疗护理水平有所提高，但 2020 年的全球统计显示，与 HIV 相关的隐球菌感染仍占所有艾滋病相关死亡的 19%。因此，开发更有效的抗隐球菌性脑膜炎的抗真菌疗法迫在眉睫。

隐球菌性脑膜炎的疾病表现和患者预后差异很大，新的抗真菌疗法需要基于精准医疗的方法，综合考虑患者和病原体的特定因素。目前，研究人员正从宿主和病原体两方面入手，探索两者之间的相互作用。已有大量证据表明，患者的免疫反应与疾病表现的差异有关，同时病原体的特定因素在导致疾病表现差异方面也起着重要作用。

此前有研究利用小鼠吸入模型，以 A/J 小鼠为宿主，重现了患者的预后情况，并确定了影响疾病进展严重程度的病原体特定因素。然而，也有研究发现人类和 A/J 小鼠的预后存在反向关系，这表明两者的生存情况与菌株基因型有关。此外，不同新型隐球菌菌株基因型影响毒力和宿主免疫反应的机制仍有待进一步研究。

近期的一项研究使用临床分离株库，探索了菌株基因型、毒力和免疫反应之间的关系，发现 A/J 小鼠对不同菌株的毒力表现存在差异，从潜伏感染到高毒力感染都有。其中，高毒力临床分离株被定义为在 A/J 小鼠中的中位生存时间比参考菌株 KN99α 提前 2 天。这些分离株（UgCl247、UgCl236 和 UgCl422）在患者队列和 A/J 小鼠中表现出两个显著特征：一是从感染隐球菌性脑膜炎后存活的患者中分离得到；二是在 A/J 小鼠肺部感染时，与 KN99α 感染相比，IFNγ 水平显著升高。IFNγ 通常被认为在人类新型隐球菌感染中具有保护作用，因此 A/J 小鼠中高毒力表型与 IFNγ 升高之间的关联出乎意料，这表明宿主特定因素对新型隐球菌临床分离株疾病进展的影响比之前认为的更为复杂。

在本研究中，研究人员旨在通过比较不同近交系小鼠的免疫反应和高毒力表型，探究 A/J 小鼠中高毒力表型的成因。研究发现，小鼠的遗传背景会影响高毒力分离株感染后的免疫反应和生存情况，同时近交系小鼠吸入模型可用于研究影响新型隐球菌疾病进展的宿主和病原体特定因素。

结果

1. 高毒力分离株的传播速度并不快于 KN99α：研究人员先前在 A/J 小鼠中鉴定出三株高毒力的新型隐球菌临床分离株：UgCl247、UgCl422 和 UgCl236。为了进一步了解高毒力表型，研究人员测试了高毒力是否源于更快速的全身感染这一假设。他们分析了感染这三株高毒力分离株的 A/J 小鼠多个器官中的真菌传播情况，发现与感染 KN99α 相比，感染高毒力分离株的小鼠肺部真菌负担显著降低，但在大脑、脾脏、肝脏、肾脏和心脏等器官的真菌负担上，高毒力分离株之间没有明显差异。这表明高毒力表型并非由更快的器官传播导致，而是肺部宿主反应可能是导致快速死亡的主要因素。
2. 高毒力表型具有 A/J 近交系遗传背景特异性：为了确定宿主遗传背景是否影响高毒力分离株的毒力，研究人员用 UgCl247、UgCl422、UgCl236 或 KN99α 感染 A/J 小鼠和 C57BL/6J 小鼠，并评估其生存情况和终末点真菌负担。结果显示，在 A/J 小鼠中，所有高毒力分离株的中位生存时间与 KN99α 相比均显著缩短，且至少比 KN99α 提前 2 天。然而，在 C57BL/6J 小鼠中，高毒力分离株的中位生存时间显著延长，高毒力表型消失。

在终末点时，A/J 小鼠感染高毒力分离株的肺部和大脑真菌负担均显著低于感染 KN99α 的小鼠；而在 C57BL/6J 小鼠中，只有 UgCl422 感染的肺部真菌负担显著低于 KN99α，大脑真菌负担则无明显差异。

A/J 近交系小鼠有三个已知的可能影响对新型隐球菌免疫反应的基因突变：补体成分 5（C5）的Hc⁰功能丧失突变、赋予对炭疽致死毒素抗性的Nlrp1b^R/R突变以及参与 NLRC4 炎性小体激活的缺陷型Naip5等位基因。为了确定这些已知基因突变是否导致高毒力表型，研究人员用代表性的高毒力分离株 UgCl247 或对照菌株 KN99α 感染具有不同上述基因位点等位基因的近交系 BALB/c、CBA/J 和 DBA/2J 小鼠，并评估其生存情况和终末真菌负担。结果发现，BALB/c 小鼠（C5 充足且Nlrp1b^s/s）感染 UgCl247 与感染 KN99α 相比，中位生存时间、终末肺部和大脑真菌负担均无差异；CBA/J（C5 充足且Nlrp1b^s/s）和 DBA/2J（C5 缺陷且Nlrp1b^R/R）小鼠感染 UgCl247 后的中位生存时间显著长于感染 KN99α，且 CBA/J 小鼠感染 UgCl247 的终末肺部真菌负担显著降低，但大脑真菌负担无明显差异；DBA/2J 小鼠感染 UgCl247 与感染 KN99α 的终末肺部和大脑真菌负担均无差异。这表明补体 C5 缺陷和Nlrp1b^R/R突变并未促进 A/J 小鼠感染 UgCl247 时的高毒力表型。

NAIP5 可通过识别细菌鞭毛蛋白激活 NLRC4 炎性小体途径。为了确定 A/J 小鼠中Naip5基因的功能缺陷是否导致高毒力，研究人员用代表性高毒力分离株 UgCl422 或对照菌株 KN99α 感染 B6.Nlrc4^-/-小鼠，并评估感染后的生存情况和终末真菌负担。结果发现，B6.Nlrc4^-/-小鼠感染 UgCl422 后的中位生存时间显著长于感染 KN99α，且终末肺部和大脑真菌负担无明显差异。因此，通过 NLRC4 炎性小体激活的 NAIP5 缺陷并未导致 A/J 小鼠的高毒力表型。虽然研究人员未能确定导致高毒力的具体宿主遗传因素，但可以明确的是，IFNγ 相关高毒力分离株的这种表型具有 A/J 近交系遗传背景特异性。
3. A/J 小鼠的高毒力可归因于肺部免疫反应：先前研究发现，A/J 小鼠感染 UgCl247、UgCl422 和 UgCl236 后，肺匀浆中的细胞因子分析显示 IFNγ 水平升高。鉴于高毒力表型具有 A/J 小鼠遗传背景特异性，研究人员进一步研究 A/J 小鼠对高毒力分离株的肺部炎症反应。他们用代表性高毒力分离株 UgCl422 或参考菌株 KN99α 感染 A/J 小鼠，并通过组织病理学分析肺部免疫反应。结果显示，与感染 KN99α 相比，感染 UgCl422 的 A/J 小鼠肺实质炎症浸润增加，且肺组织切片中诱导型一氧化氮合酶（iNOS）和嗜酸性粒细胞过氧化物酶（EPX）染色增强。由于 iNOS 通常由经典激活的巨噬细胞产生，EPX 与嗜酸性粒细胞活性相关，这表明感染 UgCl422 的小鼠肺部巨噬细胞和嗜酸性粒细胞募集增加，证实了高毒力分离株在 A/J 小鼠中引发了与 KN99α 感染不同的肺部炎症反应。
4. 高毒力感染期间的 1 型 / 17 型免疫反应具有 A/J 小鼠特异性：为了确定导致高毒力表型的宿主免疫因素，研究人员用代表性高毒力分离株 UgCl247 或对照菌株 KN99α 感染 A/J 和 C57BL/6J 小鼠，并评估细胞因子产生情况。结果发现，A/J 小鼠感染 UgCl247 后，肺部促炎细胞因子 IL-1β 和 TNF-α 的产生显著增加，同时 IFNγ 和 IL-17A 的产生也显著增加，表明 A/J 小鼠的高毒力感染由 1 型 / 17 型免疫反应驱动。相反，C57BL/6J 小鼠感染 UgCl247 后，IL-13 和 IL-5 的产生显著增加，表现为 2 型免疫反应偏向。此外，BALB/c、CBA/J 和 DBA/J 小鼠感染 UgCl247 与感染 KN99α 的细胞因子反应除了 CBA/J 小鼠感染 UgCl247 时 IFNγ 产生显著增加外，其他均无明显差异。这表明 A/J 小鼠感染 UgCl247 时观察到的 1 型 / 17 型免疫极化是高毒力表型所特有的。

研究人员还通过流式细胞术分析了感染 UgCl247、UgCl236 和 UgCl422 的 A/J 和 C57BL/6J 小鼠肺部免疫细胞。结果显示，与感染 KN99α 相比，所有高毒力分离株感染的 A/J 小鼠肺部中性粒细胞显著增加，而 C57BL/6J 小鼠中两者无差异。在 C57BL/6J 小鼠中，感染高毒力分离株时产生的 CD45⁺白细胞总数显著高于感染 KN99α。在 A/J 和 C57BL/6J 小鼠感染高毒力分离株时，单核细胞、巨噬细胞、树突状细胞（DCs）、自然杀伤（NK）细胞、嗜酸性粒细胞或 B 细胞的募集没有一致的模式。总体而言，在 A/J 小鼠感染 UgCl247 期间，中性粒细胞是主要的髓系细胞类型，而在 C57BL/6J 小鼠感染 UgCl247 期间，嗜酸性粒细胞是主要的髓系细胞类型。

有趣的是，A/J 和 C57BL/6J 小鼠感染高毒力分离株时，T 细胞反应均比感染 KN99α 时增加。研究人员假设适应性免疫反应，特别是 CD4 T 细胞的极化，可能也在驱动 A/J 小鼠的高毒力表型。结果发现，与预期一致，C57BL/6J 小鼠感染 UgCl247 和 A/J、C57BL/6J 小鼠感染 KN99α 时，表达 Th2 转录因子 GATA3 的 CD4⁺CD44⁺ T 细胞比例显著增加。更重要的是，A/J 小鼠感染 UgCl247 时，表达 Th1 转录因子 Tbet 和 Th17 转录因子 RORγT 的活化 CD4⁺CD44⁺ T 细胞比例显著增加，感染 UgCl236 和 UgCl422 时也有相同发现。此外，研究人员发现 A/J 小鼠感染 UgCl247、UgCl422 和 UgCl236 时，表达 CXCR3⁺的 CD69⁺CD103⁺肺驻留 CD4⁺ T 细胞比例显著高于感染 KN99α。这些结果表明，A/J 小鼠 IFNγ 相关高毒力感染期间的肺部 CD4 T 细胞反应是由 Th1/17 极化引起的。综合这些研究结果支持了研究人员的理论，即导致 A/J 小鼠高毒力的宿主因素是 A/J 小鼠特有的基因突变 / 多态性，且 A/J 小鼠中观察到的 1 型 / 17 型免疫极化促进了高毒力表型。
5. 新型隐球菌对不同近交系小鼠的表型反应差异：在研究不同近交系小鼠对高毒力分离株的反应时，研究人员发现参考菌株 KN99α 在不同免疫功能正常的小鼠背景中的毒力也存在差异。感染 KN99α 的 CBA/J、DBA/2J、C57BL/6J、BALB/c 和 A/J 小鼠的中位生存时间显著不同。虽然不同小鼠品系的终末大脑真菌负担没有差异，但 C57BL/6J 小鼠的肺部真菌负担显著高于其他小鼠品系。研究人员还测量了从各小鼠品系的肺部和大脑收获的隐球菌细胞体大小、荚膜大小和泰坦细胞百分比，发现感染 KN99α 后中位生存时间显著增加的 A/J 和 BALB/c 小鼠，其肺部和大脑的细胞体和荚膜尺寸相应较大；而中位生存时间显著缩短的 DBA/2J 和 CBA/J 小鼠，其肺部和大脑的细胞体和荚膜尺寸较小。在感染基因高毒力分离株时，虽然 A/J 小鼠的荚膜和细胞体尺寸通常比 C57BL/6J 小鼠大，但不同分离株之间的表型差异较大。

讨论

许多研究表明，隐球菌性脑膜炎患者的预后与宿主和病原体特定因素有关。从宿主角度看，对隐球菌性脑膜炎的不同免疫反应是影响患者预后的主要因素；从病原体角度看，新型隐球菌的毒力、细胞大小变化和基因型等对患者预后有深远影响。然而，确定宿主和病原体对新型隐球菌疾病进展和患者预后的相对贡献仍然是一个挑战。小鼠吸入新型隐球菌感染模型有助于通过控制关键病原体和宿主因素来研究感染的复杂性。

在本研究中，研究人员鉴定出三株在 A/J 小鼠遗传背景中导致高毒力的临床分离株，并研究了 A/J 小鼠对这些高毒力分离株的肺部免疫反应。然后，他们利用一系列具有不同遗传背景的近交系小鼠，了解宿主特定因素如何影响分离株的毒力，为理解宿主和病原体特定因素在决定新型隐球菌感染疾病结局中的层级关系奠定了重要基础。

先前研究表明，A/J 小鼠感染可重现人类疾病的变异性，密切相关的新型隐球菌临床分离株在 A/J 小鼠中表现出广泛的毒力表型，其中一种表型是高毒力，且高毒力临床分离株感染 A/J 小鼠时 IFNγ 产生显著增加。肌醇转运蛋白 4（ITR4）基因下游区域的突变导致ITR4下调，与 A/J 小鼠中高 IFNγ 产生和快速死亡有关，可能是导致 A/J 小鼠高毒力的病原体特定因素。但除了促炎 / IFNγ 特征外，尚不清楚哪些宿主特定因素可能导致观察到的高毒力。

本研究表明，高毒力是一个多方面的现象，涉及宿主和病原体的共同作用。A/J 小鼠对 IFNγ 相关高毒力分离株感染的肺部免疫反应以中性粒细胞浸润和 T 细胞募集为特征，且高毒力分离株感染促进了强烈的 1 型 / 17 型促炎反应。促炎细胞因子（IL-1β 和 TNF-α）的增加表明感染小鼠可能死于细胞因子风暴或免疫重建炎症综合征（IRIS）样病理。A/J 小鼠的遗传突变可能使其更易发生 IRIS 或细胞因子风暴样情况。高毒力分离株来自患有脑膜炎和晚期 HIV 且免疫功能严重受损但在初始感染新型隐球菌后存活的患者，在这些患者中可能存在两种情况：一是免疫抑制背景下增加的 Th1/Th17 极化产生更具保护性的免疫反应；二是增强的 Th1/Th17 极化使患者在免疫重建后易患 IRIS。这需要更广泛的患者队列来进一步研究。

研究人员利用具有不同免疫和遗传背景的近交系小鼠，确定了补体缺陷的Hc⁰突变、Nlrp1b^R/R等位基因和 NAIP5/NLRC4 炎性小体途径与 A/J 小鼠感染期间的高毒力无关，表明 A/J 小鼠背景中已鉴定的基因突变不是高毒力表型的原因，可能还有未被发现的遗传差异影响高毒力表型。

此外，研究还发现感染 KN99α 的 A/J、C57BL/6J、BALB/c、CBA/J 和 DBA/2J 小鼠的中位生存时间显著不同，这表明这些小鼠品系对新型隐球菌的宿主炎症反应存在差异。在未来的新型隐球菌研究中，选择合适的近交系小鼠品系应成为一个重要考虑因素。当用 C57BL/6J 小鼠感染时，分离株与 KN99α 相比不具有高毒力，且促进了以嗜酸性粒细胞炎症为特征的 Th2 主导反应。这种免疫差异在其他感染模型中也有体现，表明 A/J 和 C57BL/6J 小鼠之间未表征的遗传差异可能影响它们对病原体的不同免疫反应。

总体而言，小鼠吸入模型可用于识别影响新型隐球菌疾病进展的宿主和病原体特定因素，但在将本研究结果外推到其他高毒力分离株时需谨慎，因为临床分离株在基因上并不相同，可能通过不同途径促进毒力。本研究结果支持了 Pirofski 和 Casadevall 提出的损伤反应框架理论，即宿主免疫状态是影响新型隐球菌感染临床结局的关键因素。

材料和方法

1. 近交系小鼠品系：本研究使用的近交系小鼠品系包括 C57BL/6J（杰克逊实验室）、A/J（杰克逊实验室）、BALB