探究Borrelia miyamotoi体内抗原变异，揭秘硬蜱复发热机制

《Infection and Immunity》：Borrelia miyamotoi in vivo antigenic variation demonstrated by serotype reisolations from infected mice

Borrelia miyamotoi可在小鼠体内发生抗原变异，有助于理解硬蜱复发热（HTRF）临床特征。

　　

研究背景

Borrelia miyamotoi是一种新兴的蜱传人类病原体，虽然在系统发育上与复发热疏螺旋体（Relapsing fever Borrelia，RFB）同属一类，但它通过硬蜱（Ixodes spp.）传播，引发的疾病被称为硬蜱复发热（Hard tick relapsing fever，HTRF）。HTRF 的常见症状包括发热、肌痛、关节痛和头痛，不过复发热症状相对少见。而且，由于Borrelia burgdorferi（莱姆病病原体）也通过硬蜱传播，HTRF 与莱姆病的发病地理区域存在重叠，给准确诊断带来了挑战。

RFB 能通过改变表面蛋白结构来逃避宿主的适应性免疫反应，这一过程导致血清型变异，使得螺旋体得以增殖并引发发热复发。RFB 的血清型由位于细胞表面的单一可变主要蛋白（Variable major protein，Vmp）决定，Vmp 分为可变小蛋白（Variable small proteins，Vsps）和可变大蛋白（Variable large proteins，Vlps），分别约为 20kDa 和 36kDa 。Vmp 由位于多个线性质粒（lps）上的转录沉默假基因编码，vmp在单个位点表达，由一个活性启动子驱动。在宿主感染期间，RFB 通过在表达位点进行基因转换，用一个vmp替换另一个，从而发生抗原转换，产生新的血清型以逃避免疫反应。在B. hermsii中，这种易位通过基因内重组发生，可能涉及不同 Vmp 编码基因的嵌合表达。

此前研究发现，B. miyamotoi在基因组层面具备抗原变异的基础，其拥有与其他 RFB 类似的多个质粒上的转录非活性 Vmp 编码基因，且存在一个带有活性启动子的vmp表达位点。已有体外实验表明，B. miyamotoi在抗体压力下会发生血清型转换，但在哺乳动物感染过程中（即体内）是否发生抗原变异尚未得到证实。因此，本研究旨在探究B. miyamotoi在体内感染小鼠过程中是否发生抗原变异。

实验材料与方法

1. Borrelia miyamotoi培养及从鼠血中分离：本研究使用的Borrelia miyamotoi菌株为 CT13 - 2396，该菌株源自美国康涅狄格州一只感染的Ixodes scapularis若蜱。实验从低传代（<10 代）的甘油冻存菌株开始培养，在改良的 barbour - stoenner - kelly 培养基（bsk - r）中，34°C 培养至对数后期（约 1×10⁶ - 1×10⁷细胞 /mL）。通过与 ISE6 蜱细胞共培养的方法从鼠血中分离B. miyamotoi，具体操作是将 5μL 鼠尾血加入 45μL 磷酸盐缓冲液（PBS），取 10μL 悬液接种到含有 2mL L15B - 300 和 20% BSK - R 的 ISE6 细胞 12 孔板中，定期通过暗视野显微镜检查螺旋体生长情况，并按一定步骤进行培养基更换和菌体收集。此外，通过对 CT13 - 2396 亲本菌株在 96 孔板中进行系列稀释，在 10⁰孔中观察到种群扩增后，获得了B. miyamotoi的克隆分离株。
2. 小鼠接种实验：实验选用 10 - 18 周龄的雌性 C3H/HeJ 小鼠或 CD - 1 小鼠，由 Charles Rivers Laboratories 提供。小鼠经皮下注射 1×10⁶个螺旋体进行感染，之后根据实验设计，小鼠尾巴要么每日剪尾取血，要么按交错时间表取血。实验结束时，通过心脏穿刺进行终末采血，分离血清。
3. 表达位点 PCR 及 DNA 测序：对亲本菌株和每个分离株进行表达位点 PCR，正向引物 prExpF 特异性针对独特的表达启动子，反向引物分别为 VlpAR、Vlp25R、Vlp4R 和 Vsp1R。DNA 模板由 1mLB. miyamotoi培养物沉淀制备，PCR 反应在 20μL 体系中进行，使用特定的 PCR 预混液，不同引物的退火温度有所差异。扩增产物经 1% Tris - 乙酸 - EDTA 琼脂糖凝胶电泳后纯化，用于 DNA 测序。对于部分样本，还制备了扩增子 PacBio 文库并进行测序，使用特定软件分析测序数据；同时，也进行了 Sanger DNA 扩增子测序，利用相应软件分析数据。
4. 重组可变主要蛋白及 Western blotting：从 CT13 - 2396 基因组 DNA 中通过 PCR 扩增 VlpB、VlpC、VlpD 和 Vsp1 基因，分别克隆到特定的表达质粒中，转化到E. coli BL21 (DE3) 中表达并纯化重组蛋白。制备B. miyamotoi全细胞裂解物，将全细胞裂解物或重组蛋白进行 SDS - PAGE 电泳，转移到聚偏二氟乙烯膜上，经过封闭、孵育小鼠血清、洗涤、孵育二抗等步骤，使用化学发光试剂检测，以观察免疫反应情况。

实验结果

1. 亲本菌株 CT13 - 2396 的非克隆性：通过 PCR 和测序确认，菌株 CT13 - 2396 表达位点的 Vmp 编码基因为 AXH25_RS05645（即 Vlp5，文中统一称为 VlpA），但使用 Vlp25R 引物进行 PCR 时，出现了不太明显的扩增条带，测序发现其色谱图存在重叠峰，提示该菌株存在其他血清型。PacBio 测序进一步揭示，该菌株包含多种血清型，其中 VlpB 的 reads 数最多（>15,000），VlpA 的 reads 数相对较少（<5,000），这可能是由于 Vlp25R 引物与 VlpA 存在碱基错配，导致其扩增效率较低。此外，还检测到少量 Vsp 血清型，而使用 Vlp4R 引物未扩增出条带。综合这些结果表明，用于动物实验的亲本 CT13 - 2396 菌株为非克隆性，且 VlpA 可能为优势血清型。
2. 小鼠感染过程中的 Vmp 变异
   • 实验 1：未克隆亲本菌株感染小鼠后的血清型变化：将非克隆的 CT13 - 2396 亲本菌株接种到 C3H/HeJ 小鼠（n = 3）体内，在感染后的不同时间点从鼠血中分离B. miyamotoi。结果发现，感染后亲本血清型 VlpA 在所有小鼠中均减少至检测不到或被消除；不同小鼠分离出的血清型变异体存在差异，且从 Mouse 3 在感染后不同时间点（6dpi、9dpi、12dpi）分离出的菌株分别呈现不同的 Vlp 血清型。这表明感染后亲本血清型消失，且不同小鼠产生的变异体不同，部分变异体可能在亲本中以亚优势种群存在。
   • 实验 2：体内分离血清型接种后的抗原变异：将从感染非克隆亲本菌株 7dpi 的小鼠中分离出的 VlpB 优势血清型，接种到新的 C3H/HeJ 小鼠（n = 3）体内。结果显示，在 Mouse 4 和 Mouse 5 中，接种的 VlpB 血清型被新的变异体取代，Mouse 4 的分离株为单一变异体 VlpK，Mouse 5 的分离株为多种血清型的混合群体，且接种的 VlpB 血清型在感染过程中减少。这说明接种源自体内感染的血清型会导致新血清型的出现。
   • 实验 3：远交系小鼠接种后分离株的血清型变异：使用 CD - 1 远交系小鼠（n = 3）进行实验，从一只 CD - 1 小鼠 7dpi 的血液中分离出的菌株包含 Vlp delta 亚家族（VlpK）、Vlp alpha 亚家族（VlpJ）和 Vsp 家族三种变异体。将该混合血清型群体接种到 C3H/HeJ 小鼠后，不同小鼠在不同时间点分离出的菌株血清型不同，如 Mouse 18 在 7dpi 时为 VlpB 血清型，11dpi 时为 Vsp 血清型；Mouse 19 在 4dpi 时为 VlpK 血清型，9dpi 时为多种变异体混合，且随着时间推移，血清中 IgM 抗体对不同重组 Vmp 产生反应。这表明远交系小鼠也会发生血清型变异，且感染过程中出现了新的血清型，同时抗体反应与血清型变化相关。
   • 实验 4：克隆血清型在小鼠感染过程中的抗原变异：通过系列稀释获得 VlpA 血清型的克隆群体，接种到 C3H/HeJ 小鼠后，在两只小鼠的分离株中均未检测到 VlpA。Mouse 13 在 11dpi 时的分离株为 Vsp 血清型，Mouse 14 在 9dpi 时的分离株为多种 Vlp 血清型的混合群体。免疫印迹结果显示，小鼠血清中产生了针对 VlpA 的 IgM 抗体，提示抗原转换是由于基因转换导致的，而非亚优势种群的扩增。

讨论

本研究旨在确定B. miyamotoi在体内是否发生抗原变异，这对于理解 RFB 在哺乳动物感染和复发热患者中的免疫逃避机制至关重要，也有助于深入了解 HTRF 在人类患者中的临床表现。

研究证实，CT13 - 2396 亲本菌株中 VlpA 为优势血清型，但同时存在亚优势血清型种群。通过与 ISE6 蜱细胞共培养的方法成功从鼠血中分离出B. miyamotoi，且部分小鼠在感染过程中出现了多种变异体，表明B. miyamotoi在感染过程中发生了血清型转换。不同实验中，虽然接种的菌株和小鼠品系有所不同，但均出现了新的血清型，其中实验 4 有力地证明了抗原转换是通过基因转换而非亚优势种群的扩增实现的。

不过，研究也存在一些局限性。例如，表达位点 PCR 为定性检测，无法对亚优势变异体进行定量分析，且培养过程中自发重组的频率未知；小鼠分离株的获取时间不一致，难以确定感染过程中的复发模式；由于需在蜱细胞共培养中扩增螺旋体，可能存在对某些血清型生长有利的偏倚。未来研究应优化B. miyamotoi菌株的生长和分离条件，改进 PCR 和测序方法，以便更直接地从血液样本中鉴定血清型，从而进一步深入探究B. miyamotoi体内抗原变异的机制。

总体而言，本研究表明B. miyamotoi在感染小鼠后，会从接种的血清型抗原转换为新的优势血清型。进一步研究其体内新变异体产生的机制，将有助于更好地理解 HTRF 在人类中的临床特征，为应对这一新兴蜱传病原体提供更有力的理论支持。