探秘 Q 热病原菌：Cbu0937 蛋白在胞内复制中的关键作用

《Infection and Immunity》：Identification of a Coxiella burnetii outer membrane porin required for intracellular replication

本文揭示 Cbu0937 蛋白为鲍氏柯克斯体（Coxiella burnetii）外膜孔蛋白，对其胞内复制至关重要。

　　

引言

鲍氏柯克斯体（Coxiella burnetii）是引发 Q 热的病原体，Q 热是一种人畜共患病，有急性和慢性两种形式。急性 Q 热常表现为流感样症状，少数病例会发展为慢性 Q 热，引发如心内膜炎、肝炎等严重疾病，威胁生命。该病菌主要通过接触感染动物的气溶胶传播，感染人体后，以肺泡巨噬细胞为主要宿主细胞。

作为革兰氏阴性专性胞内病原体，C. burnetii进入宿主细胞后，会在吞噬体中，随后吞噬体与内吞细胞器融合，将细菌运送到酸化的溶酶体。C. burnetii能在溶酶体衍生的含柯克斯体液泡（Coxiella-containing vacuole，CCV）中建立生存环境并进行复制，这是其致病的显著特征。酸性环境对于激活C. burnetii代谢、启动 Dot/Icm IVB 型分泌系统转运细菌效应蛋白至关重要。这些效应蛋白可调控宿主细胞的多种过程，如囊泡运输、自噬、免疫反应、细胞死亡途径等，以利于细菌的生存和复制。

此前研究发现，cbu0937基因的转座子插入突变体（cbu0937::Tn）在细胞内复制存在缺陷。cbu0937基因编码一种假设蛋白，曾有研究认为它可能是 Dot/Icm 效应蛋白，定位于线粒体发挥作用，但具体功能尚不明确。本研究旨在深入探究 Cbu0937 蛋白的功能，以更好地理解其在C. burnetii胞内复制中的作用机制。

结果

1. cbu0937基因对C. burnetii胞内复制至关重要：研究人员用cbu0937::Tn 突变体和C. burnetii Nine Mile II 期（NMII）对照菌株（ig::Tn，转座子插入染色体中性基因间区域）感染 THP-1 巨噬细胞样细胞。通过定量基因组当量（GEs）评估胞内复制情况，利用免疫荧光显微镜测定 CCV 大小。结果显示，与对照菌株相比，cbu0937::Tn 突变体在 THP-1 细胞中 7 天内复制明显受损，GEs 显著降低；感染 5 天后，形成的 LAMP-1 阳性 CCV 非常小。在 HeLa 细胞中也观察到类似的复制缺陷。而表达野生型cbu0937的质粒可互补cbu0937::Tn 突变体的胞内复制缺陷，表明该缺陷是由cbu0937功能缺失导致的。同时，cbu0937::Tn 突变体和 ig::Tn 菌株在无细胞酸化柠檬酸盐半胱氨酸培养基 2（ACCM-2）中 11 天的复制情况相似，说明cbu0937对无细胞培养并非必需。由此可见，cbu0937在C. burnetii胞内复制过程中发挥着重要作用。
2. cbu0937基因在支持C. burnetii胞内复制中具有细胞内在作用：细菌效应蛋白通常被定义为跨液泡膜传递，在宿主细胞胞质环境中操纵宿主过程的蛋白质，具有细菌细胞外在作用。为验证 Cbu0937 是否作为效应蛋白发挥作用，研究人员进行了共感染实验。实验中使用产生绿色荧光蛋白（GFP）的野生型菌株和产生 mCherry 的转座子突变体，以便在荧光显微镜下区分不同菌株。结果发现，缺乏效应蛋白转运能力的dotA::Tn 突变体在 THP-1 细胞中存在严重的胞内复制缺陷，但与野生型C. burnetii共感染时，含野生型C. burnetii的液泡可支持dotA::Tn 突变体的复制。然而，野生型菌株与cbu0937::Tn 突变体共感染时，无法挽救后者的胞内复制缺陷，cbu0937::Tn 突变体在野生型菌株产生的液泡中数量极少。通过定量C. burnetii胞内复制进一步证实，dotA::Tn 突变体与野生型共感染时 GEs 增加，而cbu0937::Tn 突变体与野生型共感染时 GEs 略有下降，表明野生型菌株在竞争中胜过cbu0937::Tn 突变体。这说明cbu0937::Tn 突变体存在细菌细胞内在缺陷，无法在野生型C. burnetii产生的 CCV 中有效复制，暗示 Cbu0937 可能并非作为转运的效应蛋白发挥作用。

此外，研究人员还进行了另一组共感染实验，用cbu0937::Tn 突变体和产生 GFP 的dotA::Tn 突变体共感染。结果显示，cbu0937::Tn 突变体产生的液泡可支持dotA::Tn 突变体的强劲复制，与 ig::Tn 菌株产生的液泡支持的复制水平相似。而编码 Dot/Icm 效应蛋白、对胞内复制至关重要的cig57::Tn 突变体则无法有效恢复dotA::Tn 突变体的胞内复制。这进一步证实了cbu0937::Tn 突变体的缺陷是细菌细胞内在的。3. 结构预测表明cbu0937编码细菌孔蛋白：为深入了解 Cbu0937 支持C. burnetii胞内复制的机制，研究人员利用 AlphaFold3 对 Cbu0937 的结构进行建模。预测结果显示，Cbu0937 具有一个从第 77 位氨基酸到 C 末端的 16 链 β- 桶结构，且其 N 端氨基酸序列被预测含有 Sec/SPI 底物，切割位点在第 23 和 24 位氨基酸之间，这些特征表明 Cbu0937 可能是一种位于细菌外膜的蛋白质。通过 BLAST 同源性搜索发现，嗜肺军团菌（L. pneumophila）的 LbtP 蛋白是 Cbu0937 的潜在同源物。二者结构相似，均具有相似的整体折叠，根均方偏差（RMSD）值为 2.5 ?（小于 3.0 ?），距离矩阵比对（DALI）Z 评分高达 51.3（大于 20）。将 Cbu0937 的 AlphaFold3 模型与蛋白质数据库中实验确定的蛋白质结构进行比较，发现它与细菌外膜孔蛋白结构相似。例如，铜绿假单胞菌（Pseudomonas aeruginosa）的多聚磷酸盐选择性孔蛋白 OprO 与 Cbu0937 有 10% 的氨基酸序列相同，且预测二者结构相似，Cbu0937 和 LbtP 均被预测可形成同三聚体复合物，且具有延伸的 N 端区域和与其他单体相互作用的 α- 螺旋。综合这些计算机模拟数据表明，Cbu0937 是一种位于细菌外膜的孔蛋白。4. cbu0937基因编码的蛋白质定位于C. burnetii外膜：为确定 Cbu0937 的定位，研究人员构建了表达带有表位标签的 Cbu0937 蛋白的cbu0937::Tn 突变体。最初在 Cbu0937 的 C 末端添加 3×FLAG 标签，发现该蛋白无法互补cbu0937::Tn 突变体的胞内复制缺陷，表明这种修饰破坏了蛋白功能。通过结构预测，研究人员将 FLAG 表位插入 Cbu0937 的 169 和 170 位氨基酸之间的可溶性环中，构建出内部带有 FLAG 标签的 Cbu0937（Cbu0937 169-FLAG）。该变体蛋白能够稳定表达，并可互补cbu0937::Tn 突变体的胞内复制缺陷，说明表位标签未破坏蛋白功能。

研究人员通过分级分离实验确定 Cbu0937 的亚细胞定位。从表达 Cbu0937 169-FLAG 的C. burnetii无细胞培养物中制备细菌裂解物，经超速离心将蛋白质分离为可溶性和膜结合部分。结果显示，胞质 mCherry 蛋白仅存在于上清液中，证实了超速离心可有效分离胞质蛋白和膜蛋白。Cbu0937 169-FLAG 蛋白仅存在于膜结合部分，且其分级分离模式与C. burnetii外膜蛋白 OmpA 相似，在 1% DDM 可溶部分中未检测到，而在 1% SDS 可溶的外膜部分和 2.5% SDS 可溶部分中存在。此外，通过生物素标记实验进一步验证，用膜不可渗透的 EZ-Link Sulfo-NHS-SS-Biotin 对生长的C. burnetii进行生物素标记，结果显示胞质 mCherry 蛋白仅在流出液中检测到，而 FLAG 标记的 Cbu0937 和 OmpA 则被链霉亲和素磁珠拉下，表明它们是表面暴露的蛋白。这些实验结果共同证实了cbu0937编码一种位于C. burnetii外膜的细菌孔蛋白。

讨论

在 CCV 生物发生和胞内复制过程中，许多基因虽已被确定发挥关键作用，但多数基因的具体功能仍不明确。本研究明确了cbu0937基因在C. burnetii致病过程中的重要作用，证明 Cbu0937 蛋白作为一种孔蛋白，对C. burnetii的高效胞内复制必不可少。

许多对胞内复制重要的细菌因子被鉴定为 Dot/Icm 效应蛋白。C. burnetii的 Dot/Icm IVB 型分泌系统与嗜肺军团菌的分泌系统具有高度同源性，常利用嗜肺军团菌来研究C. burnetii分泌系统的功能及效应蛋白。然而，Cbu0937 的作用一直存在争议。尽管有研究表明它可能通过 Dot/Icm 依赖的机制转运到宿主细胞，但近期研究又对此提出质疑。本研究通过液泡内共感染实验表明，cbu0937::Tn 突变体存在细胞内在缺陷，且该突变体仍能形成支持dotA::Tn 突变体复制的成熟液泡，说明 Cbu0937 并非通过细菌细胞外在的效应蛋白功能促进C. burnetii胞内复制。

通过生物信息学分析，Cbu0937 蛋白被预测含有 β- 桶结构和信号肽，这与之前的计算机模拟预测和膜部分质谱分析结果一致。由于 β- 桶组装机制在进化上具有保守性，在宿主细胞中异位表达cbu0937可能无法准确反映内源性C. burnetii蛋白 Cbu0937 的生物学定位。

本研究构建了带有表位标签的 Cbu0937 变体，通过分级分离和表面标记实验证实其定位于细菌外膜。之前在宿主细胞中检测到 Cbu0937，可能是因为它是C. burnetii复制过程中释放的外膜囊泡的成分，在细菌感染宿主细胞后，外膜囊泡中的蛋白会存在于宿主细胞组分中，从而导致在宿主细胞中检测到 Cbu0937，并可能与感染细胞的线粒体共分离。综合以上研究，Cbu0937 是一种对C. burnetii胞内复制至关重要的细菌外膜蛋白，研究人员提议将cbu0937重命名为ompI（outer membrane protein for intracellular replication，用于胞内复制的外膜蛋白）。

Cbu0937 的外膜定位和孔蛋白样结构表明，它可能在获取 CCV 腔中的营养物质方面发挥重要作用。基于嗜肺军团菌外膜蛋白 LbtP 参与铁摄取且与 Cbu0937 具有同源性，推测 Cbu0937 可能也参与铁摄取过程。铁对于C. burnetii的最佳复制和生存至关重要，但目前其铁摄取机制尚不清楚。已有研究表明，C. burnetii的铁摄取可能由内膜的 FeoAB 转运体介导，但外膜转运体尚未确定。Cbu0937 是否作为C. burnetii的外膜铁转运体，还需要进一步研究，这将为深入了解这种专性胞内病原体的胞内营养获取策略提供关键信息。

材料和方法

1. C. burnetii菌株和哺乳动物细胞系：本研究使用的细菌菌株信息列于相关表格。C. burnetii菌株在 ACCM-2 培养基中，于 37°C、5% CO₂和 2.5% O₂条件下培养，根据需要添加 3 μg/mL 氯霉素（用于转座子突变体）和 / 或 375 μg/mL 卡那霉素（用于维持质粒）。THP-1 细胞和 HeLa 细胞购自美国典型培养物保藏中心（ATCC）。THP-1 细胞在添加 10% 热灭活胎牛血清（FBS）的 Roswell Park Memorial Institute（RPMI）1640 培养基中培养，在感染前用 125 ng/mL 佛波醇 12 - 肉豆蔻酸 13 - 乙酸酯分化 2 天。HeLa 细胞在添加 10% FBS 的杜氏改良 Eagle 培养基中培养，在进行相关实验前一天接种细胞。
2. 质粒和C. burnetii转化：研究中使用的质粒信息列于相关表格。质粒通过 Gibson 组装和限制性内切酶克隆构建。将质粒通过电穿孔法导入C. burnetii，电穿孔参数为 1.8 kV、500 Ω、25 μF。电穿孔后，C. burnetii在 3 mL ACCM-2 培养基中恢复 24 小时，然后添加相应抗生素。再过 4 天后，将C. burnetii涂布在含选择性抗生素的 ACCM-2 琼脂糖平板上。培养 10 天后，分离单菌落并在液体 ACCM-2 培养基中扩大培养。通过 PCR 和免疫印迹分析分别确认质粒的存在和目的蛋白的表达。
3. C. burnetii感染：将C. burnetii培养物离心，收集细胞并重悬于含 10% FBS 的 RPMI 培养基中，超声处理 10 分钟。使用dotA引物通过定量 PCR（qPCR）测定C. burnetii的 GEs。分化的 THP-1 细胞以感染复数（MOI）为 2 感染C. burnetii，HeLa 细胞以 MOI 为 50 感染。在共感染实验中，将相应菌株按 1:1 比例混合。感染约 2 小时后，用杜氏磷酸盐缓冲盐水（DPBS）洗涤细胞三次，然后换用新鲜培养基继续培养。在感染后的特定时间点收集感染细胞的裂解物。
4. 感染细胞中 GEs 的定量：用无菌无核酸酶的去离子水裂解感染细胞，离心后将沉淀重悬，加入玻璃珠，使用特定仪器裂解细菌。样品经短暂离心、煮沸后，再次离心，取上清液用于 qPCR 定量 GEs。在共感染实验中，使用针对mCherry或GFP的探针定量表达相应荧光蛋白的菌株的 GEs。
5. 免疫荧光显微镜：感染 5 天后，用 4% 多聚甲醛固定细胞，洗涤后进行通透和封闭处理。用特定的一抗和二抗对细胞进行染色，染色后用 DAPI 或 Hoechst 33342 染色 DNA，最后用抗荧光淬灭封片剂封片。使用配备特定物镜的尼康倒置荧光显微镜采集图像，并利用相关软件进行图像分析。
6. Cbu0937 的结构建模和分析：以C. burnetii RSA439 基因组中 Cbu0937 的氨基酸序列为查询序列，进行 BLASTp 搜索和 SignalP 6.0 预测。使用 AlphaFold3 生成 Cbu0937 和 LbtP 的预测结构，利用 DALI 服务器比较 Cbu0937 与蛋白质数据库中相关结构的相似性，并在特定软件中进行结构分析。
7. 细菌分级分离和免疫印迹：对L. pneumophila的分级分离方案进行修改，用于C. burnetii的分级分离实验。收集