新型隐球菌多聚磷酸酶在致病机制中的关键作用：超越多聚磷酸水平的影响

本文研究发现新型隐球菌（Cryptococcus neoformans）多聚磷酸酶影响毒力，其作用部分独立于多聚磷酸（polyP）。

　　

新型隐球菌（Cryptococcus neoformans）是一种极具威胁的侵袭性担子菌真菌病原体，对免疫功能低下的人群而言，它引发的疾病不仅常见，还可能危及生命。在艾滋病相关死亡案例中，约 19% 都与新型隐球菌感染有关。当前，针对真菌感染的治疗手段有限，且感染发病率持续攀升，开发新的抗真菌药物和更有效的诊断方法迫在眉睫。多聚磷酸（polyP）作为一种在生物体内发挥多种功能的生物聚合物，在真菌致病过程中的角色却尚不明确。深入探究新型隐球菌的致病机制，以及它与宿主免疫系统的相互作用，对于攻克隐球菌病意义重大。

新型隐球菌的致病机制与宿主免疫反应

真菌作为人类的重要病原体，常常被忽视。新型隐球菌引发的隐球菌病，每年导致约 30 万例脑膜脑炎，在撒哈拉以南非洲地区，它是艾滋病相关死亡的第二大病因。新型隐球菌主要通过吸入担孢子或干燥的酵母细胞进入人体，极易扩散至中枢神经系统，从而引发致命疾病。

新型隐球菌拥有多种毒力因子。其中，多糖荚膜是关键的毒力因素之一，它能够调节免疫反应，通过掩盖诸如几丁质和壳聚糖等免疫反应病原体相关分子模式（PAMPs），阻碍免疫细胞的识别和吞噬。荚膜中的葡糖醛酸木糖甘露聚糖（GXM）和葡糖醛酸木糖甘露半乳糖（GXMGal），还具备消耗补体和抑制中性粒细胞迁移的功能，同时能保护真菌免受氧化应激的伤害。此外，新型隐球菌产生的黑色素，作为一种免疫原性天然色素和抗氧化剂，不仅能抵御氧化损伤和温度波动，还能增强真菌对如两性霉素 B 等抗真菌药物的抗性，助力其向脑部扩散。而泰坦化，即形成具有较厚细胞壁和大液泡的巨型细胞，也是新型隐球菌逃避吞噬的独特毒力因子。

当新型隐球菌进入人体后，会在肺组织定植，并与肺部的常驻免疫细胞相遇。细胞壁上的 β - 葡聚糖、几丁质和壳聚糖等作为真菌 PAMPs，可被免疫细胞表面的模式识别受体（PRRs），如 Toll 样受体（TLRs）和 C 型凝集素受体（CLRs）识别，进而触发细胞因子分泌和吞噬反应。肺泡巨噬细胞是抵御新型隐球菌的第一道防线，它们能识别并吞噬隐球菌细胞，随后招募单核细胞和树突状细胞（DCs）至肺部。DCs 会摄取酵母细胞，并在淋巴结中将抗原呈递给幼稚的 CD4⁺T 细胞。Th1 和 Th17 细胞分泌的 IFN - γ、IL - 6 和 IL - 17，能够促进病原体的清除。然而，常见的野生型新型隐球菌菌株 H99，在 BALB/c 小鼠中会诱导产生非保护性的 Th2 免疫反应，该反应会产生 IL - 4，而 Th2 反应通常会促进真菌的扩散和增殖。

多聚磷酸在真菌中的作用及相关蛋白

polyP 是一种未被充分研究的聚阴离子无机生物聚合物，在生物体内具有多种功能。它不仅是磷和能量的储存分子，还参与渗透调节、应激适应、细胞膜形成、生物膜发育、群体感应和蛋白质靶向等过程。在真菌中，polyP 存在于不同的细胞区室，并与多种无机和有机阳离子结合。在许多细菌病原体中，polyP 对毒力有重要贡献，它能够抑制 M1 巨噬细胞的极化，抑制诱导型一氧化氮合酶（iNOS）的活性，阻碍主要组织相容性复合体 II 类（MHC II）的激活。在真菌领域，polyP 在新型隐球菌和白色念珠菌（Candida albicans）中参与阳离子抗性和解毒过程；在酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）的细胞周期进程中，polyP 在 DNA 复制和 dNTP 合成中发挥新的作用；在玉米黑粉菌（Ustilago maydis）中，polyP 直接影响毒力和症状发展。

在真菌中，有多种关键蛋白参与 polyP 的代谢。以酿酒酵母为例，其 polyP 的合成和液泡转运由一种名为液泡转运伴侣 4（Vtc4）的 polyP 合成酶介导。对于新型隐球菌而言，缺乏 Vtc4 polyP 合成酶的细胞无法检测到 polyP，这会导致其在宿主体内的增殖发生改变，并且触发血液凝固的能力受损。此外，新型隐球菌中的XPP1和EPP1基因编码外切和内切多聚磷酸酶，在磷酸盐限制的条件下，这些酶能够催化无机 polyP 的水解或动员。缺乏外切和内切多聚磷酸酶的细胞，其 polyP 水平会显著升高。

研究新型隐球菌多聚磷酸酶对毒力影响的实验设计

在本研究中，为了探究 polyP 积累以及多聚磷酸酶对新型隐球菌毒力的影响，研究人员构建了多种突变株，并进行了一系列实验。研究人员构建了缺乏 Xpp1 和 Epp1 的单突变株（xpp1?、epp1?）和双突变株（xpp1?epp1?），这些突变株均表现出 polyP 的过度积累。同时，为了确定 polyP 积累是否是导致双突变株毒力减弱和免疫反应改变的原因，研究人员还构建了缺乏 Vtc4、Xpp1 和 Epp1 的三突变株（vtc4?epp1?xpp1?），该突变株无法积累 polyP。

研究人员选用 4 - 6 周龄的雌性 BALB/c 或 C57BL/6 小鼠进行感染实验。将真菌细胞培养后，调整浓度为 2×10⁵个细胞 / 50μL，通过鼻内接种的方式感染小鼠。感染后，每天观察小鼠的状态，当小鼠体重减轻达到 15% 时，视为达到实验终点，此时对小鼠实施安乐死。通过记录小鼠的生存情况、体重变化，以及测定感染小鼠不同器官（肺、肝、脾、肾、脑）中的真菌负荷，来评估突变株的毒力。

为了深入了解突变株感染小鼠后的免疫反应变化，研究人员在感染后的第 7 天，对小鼠肺部的细胞因子进行检测。具体操作是将小鼠肺部组织匀浆，收集上清液，利用 BD cytometric Th1/Th2/Th17 试剂盒，通过流式细胞术检测白细胞介素 - 2（IL - 2）、白细胞介素 - 4（IL - 4）、白细胞介素 - 6（IL - 6）、干扰素 - γ（IFN - γ）等细胞因子的浓度。同时，对肺部组织进行组织学染色，通过苏木精 - 伊红（H&E）染色和 Movat's Pentachrome 染色，观察肺部组织的病理变化；对免疫细胞进行流式细胞术分析，检测 CD45⁺细胞、CD4⁺T 细胞、CD8⁺T 细胞等免疫细胞的数量变化。

为了探究突变株在巨噬细胞中的摄取和生存情况，研究人员利用骨髓来源的原代巨噬细胞（BMDMs）进行实验。将巨噬细胞在含有 L - 929 细胞条件培养基（LCCM）的 DMEM 培养基中培养 6 天，诱导分化为 BMDMs。实验前，用 150ng/mL 佛波酯（PMA）刺激 BMDMs 1 小时，然后将野生型或突变株的酵母细胞用单克隆抗体 18B7 进行调理 1 小时，再以 10:1 的感染复数（酵母细胞：巨噬细胞）感染 BMDMs。分别在感染后 2 小时和 24 小时，通过裂解巨噬细胞，在 YPD 琼脂平板上进行菌落计数，测定内化酵母细胞的数量，以此评估突变株在巨噬细胞中的摄取和生存能力。

研究人员还对突变株的细胞表面结构和毒力因子进行了检测。通过印度墨汁染色和扫描电子显微镜（SEM）观察突变株的荚膜结构和形态；在含有 L - 3,4 - 二羟基苯丙氨酸（L - DOPA）的培养基中培养突变株，测定其黑色素的产生量；用 Calcofluor White（CFW）染色，通过流式细胞术检测突变株的几丁质含量。同时，将突变株接种在含有不同应激和药物的培养基上，如 SDS、刚果红、CFW、咖啡因、过氧化氢（H₂O₂）等，观察突变株对这些物质的敏感性，以评估其应对膜和细胞壁应激的能力。

此外，研究人员对突变株的线粒体相关表型进行了分析。利用 2',7' - 二氯荧光素二乙酸酯（DCFDA）染色，通过流式细胞术检测突变株细胞内活性氧（ROS）的积累情况；用 MitoTracker Orange 和壬基吖啶橙（NAO）染色，通过荧光显微镜观察突变株线粒体的形态；用 JC - 1 染料染色，通过流式细胞术检测突变株线粒体的膜电位。同时，将突变株接种在含有电子传递链抑制剂（如鱼藤酮、抗霉素 A、粘噻唑菌醇、水杨基羟肟酸（SHAM）、氰化钾（KCN））的培养基上，观察突变株的生长情况，评估其对线粒体应激的反应。

新型隐球菌多聚磷酸酶影响毒力的实验结果

实验结果显示，与野生型菌株相比，缺乏多聚磷酸酶的突变株毒力明显减弱。具体表现为，感染野生型菌株 H99 的小鼠在感染后第 16 天全部死亡，而感染xpp1?、epp1?单突变株和xpp1?epp1?双突变株的小鼠，疾病症状和死亡时间均出现延迟。在监测小鼠体重变化时发现，感染野生型菌株的小鼠在 15 天内体重持续下降，而感染双突变株的小鼠体重下降更为缓慢。在实验终点测定真菌负荷时，发现双突变株感染小鼠的肝脏、肾脏、脾脏和大脑中的菌落形成单位（CFUs）显著高于野生型菌株，且肺部病理变化更为严重，出现真菌在肺部各区域生长并取代肺组织的现象（形成隐球菌瘤），感染后期小鼠出现呼吸困难。

在感染早期（第 7 天），感染xpp1?epp1?双突变株的小鼠，其肝脏中的真菌负荷显著低于野生型菌株，而在大脑、肺部和脾脏中的真菌负荷与野生型菌株相当。对肺部细胞因子的检测发现，感染双突变株的小鼠肺部 IL - 4 水平显著降低，这表明多聚磷酸酶的缺失改变了免疫系统对真菌细胞的感知，导致免疫反应失衡。组织学分析显示，野生型菌株感染小鼠的肺部，在细支气管周围有大量真菌细胞存在，免疫细胞浸润明显；而双突变株感染小鼠的肺部，真菌细胞较少，免疫细胞浸润也较少。进一步通过流式细胞术分析免疫细胞发现，双突变株感染小鼠肺部的 CD45⁺细胞、CD4⁺T 细胞、CD8⁺T 细胞、中性粒细胞和嗜酸性粒细胞数量均显著减少，单核细胞衍生的巨噬细胞数量也有所下降，但 B 细胞、Ly6C^-巨噬细胞和单核细胞数量无明显差异。

三突变株（vtc4?epp1?xpp1?）同样表现出毒力减弱的现象。感染三突变株的小鼠疾病症状和死亡时间延迟，体重下降更为缓慢，在实验终点时，肺部、肝脏、肾脏、脾脏和大脑中的真菌负荷显著增加。与双突变株类似，三突变株感染小鼠的肺部病理变化严重，出现组织损伤和炎症浸润。此外，研究人员还发现，双突变株和三突变株的酵母细胞在体内的直径明显小于野生型菌株，这可能是导致其在感染器官中真菌负荷增加的原因之一。

在巨噬细胞摄取和生存实验中，研究人员发现，与野生型菌株相比，vtc4?、xpp1?epp1?和vtc4?epp1?xpp1?突变株的酵母细胞在感染 2 小时后，被 BMDMs 摄取的数量明显减少。在感染 24 小时后，xpp1?epp1?和vtc4?epp1?xpp1?突变株的酵母细胞在 BMDMs 中的积累量显著降低，表明其在巨噬细胞中的生存能力减弱。

对突变株细胞表面结构和毒力因子的检测发现，xpp1?epp1?双突变株和vtc4?epp1?xpp1?三突变株的荚膜明显小于野生型菌株和vtc4?突变株，且荚膜纤维更为分散。同时，这两种突变株的黑色素产生量也显著减少，几丁质含量降低。在应对膜和细胞壁应激方面，所有突变株对 SDS 均更为敏感，但在含有咖啡因、CFW 和刚果红的培养基上生长正常。

线粒体相关表型分析显示，xpp1?epp1?和vtc4?epp1?xpp1?突变株细胞内的 ROS 水平显著高于野生型菌株，而vtc4?突变株的 ROS 水平则低于野生型菌株。在应对氧化应激时，双突变株和三突变株对 H₂O₂更为敏感。通过对线粒体形态的观察发现，在无氧化应激的情况下，所有突变株的线粒体呈球状的比例均低于野生型菌株，而呈弥散状染色的比例更高；在 H₂O₂处理后，三突变株线粒体呈球状的比例下降最为明显，双突变株和三突变株的弥散状染色线粒体比例更高。此外，双突变株和三突变株对电子传递链抑制剂 SHAM 和 KCN 更为敏感，线粒体膜电位降低。

新型隐球菌多聚磷酸酶影响毒力的机制探讨

综合以上实验结果，研究人员认为多聚磷酸酶 Epp1 和 Xpp1 在新型隐球菌的致病过程中发挥着重要作用，且其作用至少部分独立于 polyP 积累。双突变株和三突变株在巨噬细胞中的生存能力下降，可能是导致其毒力减弱的重要原因之一。同时，突变株对 ROS 更为敏感，这可能与线粒体功能受损有关。线粒体在真菌病原体适应各种应激条件中起着关键作用，多聚磷酸酶的缺失可能影响了线粒体的形态和功能，导致线粒体膜电位降低，ROS 积累增加，进而影响了真菌的生存和毒力。

在毒力因子方面，突变株的荚膜和黑色素形成减少，这两种毒力因子对于新型隐球菌逃避宿主免疫和在体内生存至关重要。荚膜能够阻碍免疫细胞的识别和吞噬，黑色素则有助于真菌抵御氧化应激和抗真菌药物。因此，荚膜和黑色素的减少可能使得突变株更容易被免疫系统清除，从而降低了毒力。

此外，研究人员还发现，双突变株和三突变株的细胞在体内的直径较小，这与之前的研究结果一致，即小细胞更有利于真菌的肺外扩散。但有趣的是，感染双突变株的小鼠在感染早期真菌负荷较低，免疫细胞数量减少，这表明突变株在感染早期可能难以建立有效的感染，需要一定时间来适应宿主环境。随着感染的进展，突变株可能通过某种机制在肺部组织中存活并增殖，最终导致疾病的发生。

在免疫反应方面，感染xpp1?epp1?双突变株的小鼠肺部免疫细胞数量减少，IL - 4 水平降低。IL - 4 在真菌免疫中具有负面作用，它能够极化巨噬细胞，促进细胞内病原体的增殖。因此，双突变株感染可能促进了保护性的 Th1 型免疫反应，有助于在感染早期清除病原体。但由于突变株在巨噬细胞中的摄取和生存能力下降，以及免疫细胞数量的减少，使得突变株在后期仍能在肺部组织中存活并导致疾病。

研究新型隐球菌多聚磷酸酶的意义与展望

本研究首次揭示了新型隐球菌中多聚磷酸酶对毒力的重要影响，为深入理解新型隐球菌的致病机制提供了新的视角。研究发现多聚磷酸酶的作用部分独立于 polyP 积累，这为开发针对新型隐球菌的抗真菌药物提供了新的潜在靶点。未来的研究可以进一步探究多聚磷酸酶的具体作用机制，包括其在调节基因表达、参与信号通路等方面的功能。

同时，研究人员还可以深入研究 polyP 与多聚磷酸酶之间的相互关系，以及它们与其他细胞成分的相互作用。例如，多聚磷酸酶是否通过调节 polyP 的代谢，影响细胞内其他生物分子的功能，进而影响真菌的毒力和生存能力。此外，研究多聚磷酸酶与其他毒力因子之间的协同作用，也将有助于全面了解新型隐球菌的致病机制。

在免疫反应方面，需要进一步研究新型隐球菌感染过程中免疫细胞与真菌之间的动态相互作用。明确多聚磷酸酶如何影响免疫细胞的功能和免疫反应的调节，对于开发新的免疫治疗策略具有重要意义。例如，是否可以通过调节多聚磷酸酶<