酵母耐受乙酸胁迫的分子机制研究：转录因子Pdr1和Yap1的关键作用

《Applied and Environmental Microbiology》：ChIP-exo and CRISPRi/a illuminate the role of Pdr1 and Yap1 in acetic acid tolerance in Saccharomyces cerevisiae

本研究揭示了转录因子Pdr1和Yap1在酵母耐受乙酸胁迫中的重要作用，为工业酵母菌株的改良提供了新思路（CRISPRi/a、ChIP-exo）。

　　在生物炼制领域，利用可再生植物生物质作为酵母的工业原料一直面临瓶颈，主要原因是生物质预处理过程中会释放出乙酸等抑制性物质。乙酸对酵母细胞造成多种胁迫，影响其生长和代谢效率。本研究以酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）为对象，深入探究了转录因子Pdr1和Yap1在乙酸耐受性中的作用机制，并通过CRISPR干扰/激活（CRISPRi/a）技术对相关基因表达进行调控，以期培育出更耐乙酸胁迫的酵母菌株，提升其在工业应用中的性能。

研究背景

酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）作为一种重要的工业微生物宿主，被广泛应用于生物燃料、脂肪酸、氨基酸和制药等生物技术生产过程。然而，其对环境胁迫的敏感性，尤其是对乙酸的耐受性较差，限制了其在工业生产中的应用潜力。乙酸是糖发酵的常见副产物，也是木质纤维素水解产物中的主要抑制剂之一。乙酸对细胞的多种生理过程产生不利影响，挑战细胞的pH稳态，导致细胞活力和生产力下降。因此，深入研究酵母耐受乙酸的分子机制具有重要意义。

研究方法

研究者首先利用染色质免疫沉淀测序（ChIP-exo）技术分析了转录因子Pdr1和Yap1在乙酸胁迫下的基因结合情况。ChIP-exo通过化学交联剂将DNA与结合的蛋白质交联，然后利用特异性抗体进行免疫沉淀，最后通过测序分析确定转录因子结合的基因启动子区域。此外，研究者还采用了CRISPR干扰/激活（CRISPRi/a）技术来调控Pdr1和Yap1的表达水平。CRISPRi/a利用失活的Cas9蛋白（dCas9）与转录抑制子/激活子偶联，实现对目标基因表达的瞬时调控。通过设计针对Pdr1和Yap1启动子区域的多个单导向RNA（sgRNA），研究者成功构建了一系列CRISPRi/a菌株，并在含有乙酸的培养基中对其生长性能进行了评估。

实验结果

实验结果显示，在含有40 mM乙酸的培养基中，Pdr1和Yap1的结合位点显著增加，尤其是在基因转录起始位点（TSS）上游约500 bp的区域内。与不含乙酸的培养基相比，Pdr1的结合位点从57个增加到130个，其中90个仅在乙酸存在时被结合；Yap1的结合位点从44个增加到211个，其中173个仅在乙酸存在时被结合。基因本体（Gene Ontology, GO）分析表明，这些在乙酸胁迫下被特异性结合的基因主要涉及“小分子生物合成过程”、“碳水化合物代谢过程”、“羧酸代谢过程”和“小分子代谢过程”。此外，研究还发现，Pdr1和Yap1在乙酸胁迫下共同结合了54个基因，这些基因在氨基酸合成和ABC转运蛋白编码方面具有较高的结合富集度。

在CRISPRi/a实验中，研究者发现，与对照菌株相比，CRISPRa靶向YAP1的菌株在120 mM乙酸培养基中的生长速率显著提高，而CRISPRi靶向PDR1的菌株则表现出更好的生长性能。具体而言，YAP1a-sgRNA6菌株在乙酸胁迫下的生长曲线较为均匀，而其他菌株则表现出典型的双相生长曲线。对于PDR1的CRISPRi菌株，除了PDR1i-sgRNA8外，其他菌株在乙酸胁迫下的生长速率均显著提高，其中PDR1i-sgRNA5的生长速率提高了22%。这些结果表明，通过CRISPRi/a技术对Pdr1和Yap1的表达进行调控，可以显著提高酵母在乙酸胁迫下的生长性能。

研究结论

本研究通过ChIP-exo和CRISPRi/a技术，深入揭示了转录因子Pdr1和Yap1在酵母耐受乙酸胁迫中的重要作用。研究结果表明，Pdr1和Yap1在乙酸胁迫下结合的基因数量显著增加，且这些基因主要参与氨基酸合成、ABC转运蛋白编码和氧化应激响应等过程。通过CRISPRi/a技术对Pdr1和Yap1的表达进行调控，可以显著提高酵母在乙酸胁迫下的生长性能。这些发现不仅为理解酵母耐受乙酸的分子机制提供了新的见解，还为通过基因工程手段培育更耐乙酸胁迫的酵母菌株提供了理论依据和实践指导，有望推动生物炼制领域的技术进步和可持续发展。