低温条件下三氯生降解酶TcsAB的理性工程化改造及应用研究

《Applied and Environmental Microbiology》：Computer-directed rational engineering of dioxygenase TcsAB for triclosan biodegradation under cold conditions

本研究通过计算机辅助的理性设计策略，成功改造了三氯生（TCS）降解酶TcsAB，使其在低温条件下展现出更高的催化效率，为新兴污染物的环境生物修复提供了新思路和有效工具。

　　

研究背景与意义

近年来，随着合成抗菌剂三氯生（Triclosan, TCS）在水环境中的广泛检出，其对生态系统和人类健康的潜在风险引起了广泛关注。TCS具有生物富集性、内分泌干扰性和生殖毒性，且在污水处理过程中难以被高效降解。尤其是在低温条件下，其降解效率更是大幅降低，这限制了生物修复技术在实际环境中的应用。因此，开发能够在低温条件下高效降解TCS的生物修复技术具有重要的理论和实践价值。

研究方法与实验设计

本研究采用计算机辅助的理性设计策略，结合环工程和N端截短技术，对TcsAB进行改造，以提高其在低温条件下的催化活性。首先，通过AlphaFold2和AlphaFold3对TcsA、TcsB及TcsAB复合物的结构进行预测，并利用分子动力学（Molecular Dynamics, MD）模拟分析其在不同温度下的稳定性。接着，针对TcsA的底物结合口袋周围的环区域进行定点突变，筛选出能够提高酶活性的突变位点，并构建了相应的突变体。同时，对TcsB进行N端截短，以降低其热稳定性，增强其在低温下的灵活性。最终，将改造后的TcsAB基因导入工程菌株Pseudomonas knackmussii B13中，构建了能够在低温条件下高效降解TCS的工程菌株。

实验结果与分析

实验结果表明，改造后的TcsAB突变体（TcsA^{Y277P/F279P/S311W/A313W}TcsB^{N-terminal truncation}）在15°C时的催化效率比野生型提高了2.54倍。分子动力学模拟结果显示，突变引入的底物结合口袋增加了灵活性，使酶能够以更有利的构象结合底物，从而提高了催化活性。此外，改造后的工程菌株P. knackmussii B13-pBBR-M在15°C条件下对TCS的降解速率显著高于对照菌株，且在30°C条件下仍保持良好的降解能力。

研究结论与展望

本研究通过理性工程化改造，成功提高了TcsAB在低温条件下的催化活性，为TCS的生物修复提供了一种高效、节能的新方法。该研究不仅为新兴污染物的环境治理提供了理论支持和技术手段，也为其他低温活性酶的设计和改造提供了参考。未来的研究可以进一步探索该工程菌株在实际环境中的应用潜力，并优化其降解效率和稳定性，以期实现更广泛的环境修复目标。