肠道双歧杆菌基因组编辑新突破：CRISPR-Cas9 碱基编辑器系统（cBEST）的构建与应用

《Applied and Environmental Microbiology》：Highly efficient CRISPR-Cas9 base editing in Bifidobacterium with bypass of restriction modification systems

本文构建了用于双歧杆菌基因组编辑的 CRISPR-Cas9 胞嘧啶碱基编辑器系统（cBEST），为研究和应用开辟新途径。

　　

一、研究背景

在人体肠道微生物群落的大舞台上，双歧杆菌（Bifidobacterium）作为益生菌界的 “明星成员”，凭借其调节免疫反应、增强癌症免疫治疗效果、维护肠道屏障功能、维持代谢稳态以及塑造不同生命阶段肠道菌群组成等诸多有益功效，成为了科研人员眼中的焦点。多组学分析和生物信息学的蓬勃发展，让我们得以更深入地窥探这些肠道共生菌在人体生理和疾病进程中所扮演的关键角色。然而，目前大多数关于双歧杆菌的研究，主要是基于特定菌株与宿主表型之间的关联，因果关系的确定也多依赖于目标菌株的接种或合成微生物群落的使用，对于其背后分子机制的理解仍较为匮乏。

遗传操作技术是解开双歧杆菌与宿主相互作用分子机制奥秘的 “金钥匙”。但现实却给科研人员们泼了一盆冷水，一方面，可用于双歧杆菌遗传操作的工具十分有限；另一方面，广泛存在于双歧杆菌中的限制修饰（RM）系统，如同坚固的 “堡垒”，严重阻碍了外源 DNA 的进入，极大地限制了对这些细菌的遗传改造。在现有的基因组编辑方法中，虽然利用内源性 I 型 CRISPR-Cas 系统和同源定向修复在部分双歧杆菌菌株中实现了基因组编辑，但该方法并不适用于所有菌株。而外源性 II 型 CRISPR-Cas 系统，如广泛应用的酿脓链球菌（Streptococcus pyogenes）的 CRISPR-Cas9 系统（spCas9），虽具有可预测性和潜在的便携性，但需要转化更大的编辑质粒，且基于 DNA 双链断裂（DSB）的编辑方法容易出错，可能导致基因组不稳定和细胞毒性。相比之下，碱基编辑技术无需 DSB 和供体模板 DNA 即可实现精准的点突变，在人类疾病治疗领域展现出巨大潜力，但在双歧杆菌中的应用却尚未得到充分探索。

二、研究成果

（一）双歧杆菌启动子的表征

启动子作为基因表达的 “开关”，精确调控其强度对于微生物基因工程至关重要。然而，已知可用于双歧杆菌异源基因表达的天然启动子数量有限，寻找不同强度的通用启动子，尤其是最小尺寸的合成启动子，成为构建双歧杆菌基因组编辑工具箱的关键。

研究人员在双歧杆菌长亚种（Bifidobacterium longum）NCIMB 8809 中，对一系列选定的天然和合成启动子的相对强度展开了深入探究。他们以 pMGC-mCherry 质粒为基础，该质粒利用双歧双歧杆菌（Bifidobacterium bifidum）S17 的 gap 基因启动子（P_gap）驱动 mCherry 表达。实验结果显示，来自链霉菌（Streptomyces）的组成型启动子 P3 和 P6，虽能在B. longum NCIMB 8809 中驱动 mCherry 表达，但表达水平相较于 P_gap明显较低。而在合成启动子中，合成四环素诱导型 tcp830 启动子（P_tcp830）表现最为突出，展现出最高的表达水平；合成 kasO启动子（P_kasO）及其变体 P_kasO*17，则呈现出与 P_gap相似的中等表达水平。除 P_gap和 P_tcp830外，其他测试启动子在指数生长期和稳定期均能产生较为一致的 mCherry 表达。

为了检验这些启动子的通用性，研究人员将携带不同启动子的 mCherry 报告质粒转化到青春双歧杆菌（Bifidobacterium adolescentis）DSM 20083 中。结果发现，尽管在B. adolescentis DSM 20083 中 mCherry 荧光总体更高，但强弱启动子的趋势与在B. longum NCIMB 8809 中观察到的相似。这一系列实验成功鉴定出了不同强度的启动子，为在双歧杆菌中控制异源基因表达提供了有力工具。

（二）cBEST 在B. longum NCIMB 8809 中的功能验证

基于上述启动子的研究成果，研究人员精心构建了三组碱基编辑器（cBEST），并在B. longum NCIMB 8809 中进行功能测试。他们选用强启动子 P_tcp830和中等强度启动子 P_kasO^17tss来驱动 sgRNA 表达，同时考虑到 Cas9 表达水平对细胞毒性和基因组编辑效率的影响，选择中等强度启动子 P_kasO和相对较弱的启动子 P3 来表达碱基编辑器（由 spCas9n (D10A) 与 APOBEC1 和 UGI 融合而成）。构建的三种 cBEST 质粒与一锅法金门组装（Golden Gate assembly）的原间隔序列兼容。

为了评估 cBEST 质粒在双歧杆菌基因组编辑中的能力，研究人员将目标锁定在 SpeE 基因上，该基因被预测参与 5'- 甲硫腺苷（MTA）的生物合成，可能与抗肥胖作用相关。他们挑选了四个靶向 SpeE 基因区域的原间隔序列，构建了 12 种编辑质粒，并将其转化到B. longum NCIMB 8809 中。通过对转化子的桑格测序分析，确定基因编辑效率为所需碱基编辑转化子占总测序转化子的比例。结果显示，在不同的 cBEST 构建体中，cBEST4 表现最为出色，在涉及四个不同原间隔序列的八次独立转化中，共获得 8 个转化子，其中 6 个（75%）实现了编辑，而 cBEST2 和 cBEST3 的编辑效率分别为 27.2%（22 个转化子中有 6 个编辑成功）和 16.7%（6 个转化子中有 1 个编辑成功）。这一结果充分表明，精确调整碱基编辑器和 sgRNA 的表达对于实现高效基因组编辑至关重要。

随后，研究人员采用液相色谱 - 串联质谱（LC-MS/MS）代谢分析技术，对 SpeE (Q198*) 菌株的 MTA 生产情况进行评估。令人意外的是，在该菌株中并未观察到 MTA 水平的调节，且作为 SpeE 产生 MTA 的底物 —— 中间产物 dcSAM 也未被检测到。这可能是由于存在尚未报道的参与 MTA 生产的酶，或者是 SpeE (Q198*) 菌株中仍存在残余的 SpeE 表达或功能，这一现象需要进一步实验加以证实。

（三）RM 缺失菌株转化效率的提升

在研究过程中，研究人员发现 cBEST 质粒转化双歧杆菌时，获得的转化子数量极少，推测除了 Cas 相关的毒性外，RM 系统对外国 DNA 的限制可能是阻碍双歧杆菌基因组编辑的主要瓶颈。RM 系统通过修饰甲基转移酶（MTase）和限制性内切酶（REase）这两种主要酶成分，区分外源 DNA 和内源性基因组 DNA。MTase 通过向胞嘧啶或腺嘌呤添加甲基来保护 DNA，而 REase 则切割缺乏甲基化的特定序列。

为了深入探究 RM 系统对B. longum NCIMB 8809 转化和基因编辑效率的影响，研究人员对其天然 RM 系统进行了改造。基于双歧杆菌 RM 系统的泛基因组分析及其预测的识别基序，他们利用 cBEST 质粒分别敲除了B. longum NCIMB 8809 中的三个 REase 基因（HsdR、EcoRII_0606 和 EcoRII_0983），并构建了单敲除、双敲除和三敲除突变菌株。实验结果显示，这些 REase 突变菌株在生长方面与野生型菌株并无明显差异，且所有 cBEST 转化菌株在无选择培养基中传代几次后，均可去除 cBEST 质粒，这为后续构建双敲除和三敲除突变菌株的顺序碱基编辑提供了便利。

正如预期的那样，当三个预测的 RM 系统被破坏后，研究人员观察到 REase 敲除菌株的转化效率得到了显著提升，提升幅度从 1 到 5 个数量级不等，具体取决于所使用的质粒。例如，携带 HsdR 识别序列的 pMGC-Cas9n 质粒，在 HsdR (W29*) 菌株中的转化效率提高了约 30 倍；而不含 HsdR 识别序列的 pMGC-mCherry 质粒，在 HsdR (W29*) 菌株中的转化效率与野生型菌株相比则保持不变。尤为突出的是，0606 (Q64*) 0983 (W138*) HsdR (W29*) 三重突变菌株对 pMGC-Cas9n 质粒的转化效率相较于野生型提高了约 300,000 倍，达到了 10⁶ - 10⁷ CFU/μg 的高效水平。这些结果清晰地揭示了这三个 RM 系统在限制外源 DNA，尤其是像 pMGC-Cas9n 这样的大质粒进入B. longum NCIMB 8809 中的重要作用。

（四）RM 缺失菌株基因编辑效率的增强

除了转化效率，RM 系统对基因组编辑效率的影响也备受关注。研究人员以 cBEST2-SpeE-PS1 质粒为工具，在不同的B. longum NCIMB 8809 REase 突变菌株中评估基因编辑效率。结果发现，RM 系统被破坏后，菌株的转化效率和基因组编辑效率均得到了显著增强。在 0606 (Q64*) 0983 (W138*) HsdR (W29*) 菌株中，不仅获得了更多的转化子，而且对于三种不同的 cBEST 构建体，随机挑选的所有（15/15）转化子均在预期编辑窗口内实现了 C-to-T 编辑。进一步的实验表明，在该突变菌株中，高达 100%（5/5）随机挑选的转化子能够产生所需的 MetK (Q134*) 突变，而在野生型B. longum NCIMB 8809 菌株中，这一突变却很难实现。此外，MetK (Q134*) 细胞中 SAM 水平显著降低，而 L - 蛋氨酸水平相似，这与 MetK 功能的破坏相吻合。

为了验证 RM 系统的破坏是否也能提高其他双歧杆菌的基因组编辑效率，研究人员对野生型Bifidobacterium adolescentis DSM 20083 和实验室先前分离的 RM 缺失菌株 Sau3AI (Q260*) 进行了比较。实验结果表明，在 RM 缺失的 Sau3AI (Q260*) 菌株中，使用 pMGC-mCherry 和 pMGC-Cas9n 质粒的转化效率显著提高；同时，该菌株的基因组编辑效率也得到增强，对于 cBEST3 和 cBEST4，随机选择的转化子中有 100%（5/5）在预期编辑窗口内实现了所需的 C-to-T 编辑，这与在B. longum NCIMB 8809 中的观察结果相似。

综合以上实验结果，充分证明了天然 RM 系统是双歧杆菌转化和基因组编辑的主要障碍，而破坏 RM 系统能够显著提高这些遗传难治性细菌的基因组编辑效率。

（五）工程双歧杆菌菌株实现简化的基因组编辑流程

RM 缺失菌株的出现，为绕过 RM 系统实现双歧杆菌高效转化和基因组编辑带来了新的契机。研究人员发现，通过将质粒先在 REase 突变菌株中传代，利用其保留的内源性甲基化机制对 DNA 进行甲基化修饰，能够成功绕过亲本菌株中的天然 RM 系统。实验结果显示，将从B. longum NCIMB 8809 的 0606 (Q64*) 0983 (W138*) HsdR (W29*) 菌株和B. adolescentis DSM 20083 的 Sau3AI (Q260*) 菌株中分离得到的 pMGC-Cas9n 质粒，转化回各自的野生型菌株时，与未甲基化的质粒相比，转化效率提高了两到三个数量级以上。同时，研究还发现，宿主甲基化的质粒在非同源双歧杆菌菌株中产生的转化子数量显著减少，即使是同一物种内的不同菌株，也存在 DNA 甲基化模式的不相容性。这表明，这种 RM 规避策略依赖于目标双歧杆菌菌株同源 REase 突变体的可用性。

鉴于 REase 突变菌株具有较高的转化和基因组编辑效率，研究人员推测利用宿主甲基化质粒绕过 RM 系统，有望增强野生型菌株的基因组编辑效果。他们以B. longum NCIMB 8809 中的胆汁盐水解酶（bsh）基因作为目标，该基因在胆汁酸代谢中起着关键作用。胆汁酸作为重要的代谢物，对宿主的脂肪乳化、葡萄糖和脂质稳态、胆固醇代谢以及肠道菌群组成均具有重要影响。实验结果显示，非甲基化的 cBEST 质粒在野生型B. longum NCIMB 8809 中产生的转化子极少，且根据所使用的原间隔序列不同，编辑效率普遍较低。而通过使用宿主甲基化质粒绕过天然 RM 系统后，转化子数量和基因编辑效率大幅提升，无论使用何种原间隔序列，均能实现 100% 的编辑效率。

0606(Q64*)0983(W138*)HsdR(W29*) B. longum NCIMB 8809 菌株的出色表现，促使研究人员进一步优化其作为模型菌株的应用，简化克隆和基因组编辑流程。他们在体外通过金门组装构建好一体化 cBEST 质粒后，直接将组装混合物转化到 0606 (Q64*) 0983 (W138*) HsdR (W29*) B. longum NCIMB 8809 菌株中，结果在目标 bsh-PS1 基因组位点实现了 100% 的编辑。此外，在质粒去除之前，从这些菌株中重新分离得到的宿主甲基化 cBEST 质粒，还可用于靶向野生型B. longum NCIMB 8809 菌株中的相同基因组位点。这种通过 0606 (Q64*) 0983 (W138*) HsdR (W29*) B. longum NCIMB 8809 菌株简化的工作流程，避免了使用大肠杆菌（E. coli）作为编辑质粒制备的宿主，能够在一次转化中同时生成宿主甲基化的编辑质粒和基因组工程双歧杆菌菌株（去除质粒后）。而使用亲本B. longum NCIMB 8809 菌株采用该工作流程时，却无法获得转化子。这些结果充分展示了利用 RM 缺失双歧杆菌菌株进行简化基因组编辑的巨大潜力。

（六）cBEST 介导的基因组编辑实现多种双歧杆菌的靶向代谢扰动

为了验证 cBEST 系统是否适用于B. longum NCIMB 8809 和B. adolescentis DSM 20083 以外的双歧杆菌菌株，研究人员利用 bsh 基因在双歧杆菌中高度保守的特性，尤其是在 bsh-PS1 靶区域具有 100% 的同一性，尝试使用为B. longum NCIMB 8809 构建的同一组 cBEST 质粒，对婴儿双歧杆菌（B. infantis）DSM 20088 和B. longum DSM 20219 中的 bsh 基因进行破坏。为了便于不同菌株之间的直接比较，他们使用了从E. coli JM110 中分离得到的未甲基化质粒。实验结果显示，cBEST 构建体在不同菌株中的编辑效率各不相同，再次强调了微调碱基编辑器和 sgRNA 表达的重要性。有趣的是，在不同菌株和 cBEST 构建体中，编辑窗口内的 C-to-T 编辑模式存在差异。例如，在B. longum DSM 20219 中，cBEST2-bsh-PS1 质粒产生的 C-to-T 编辑未引入终止密码子，而 cBEST3-bsh-PS1 和 cBEST4-bsh-PS1 质粒则能够以 100% 的基因编辑效率引入终止密码子；对于同一 cBEST4-bsh-PS1 质粒，在B. longum NCIMB 8809、B. longum DSM 20219 和B. infantis DSM 20088 中，C-to-T 编辑的位置也存在差异。这可能是由于碱基编辑器表达水平的差异和 / 或基因组甲基化模式的多样性所致。

由于 BSH 参与甘氨酸或牛磺酸结合胆汁酸的去结合过程，为了确定 bsh (W22*) 突变体中 bsh 基因功能是否被破坏，研究人员对添加了牛磺胆酸（TCA）的细菌培养物中的 TCA、胆酸（CA）和脱氧胆酸（DCA）水平进行了定量分析。结果显示，表达 BSH 的野生型和 0606 (Q64*) 0983 (W138*) HsdR (W29*) B. longum NCIMB 8809 菌株在含有 TCA 的培养基中培养时，能够消耗 TCA 并产生 CA；而 bsh (W22*) 菌株则无法代谢 TCA，在其培养物中检测不到 CA。在 bsh 缺陷的B. infantis DSM<