微塑料促进大肠杆菌耐药性发展：机制、影响与防控新挑战

《Applied and Environmental Microbiology》：Effects of microplastic concentration, composition, and size on Escherichia coli biofilm-associated antimicrobial resistance

该研究揭示微塑料（MPs）对大肠杆菌耐药性的影响，为应对 AMR 危机提供关键依据。

　　

引言

全球塑料的广泛使用与不当处置，已成为环境和公共卫生领域的重大难题。自 1964 年起，塑料使用量增长了 20 倍，预计到 2060 年，全球未妥善管理的垃圾将达到每年 155 - 265 兆吨。在此背景下，微塑料（MPs）的检出率显著上升。MPs 是指尺寸在微米到毫米范围的难溶性合成颗粒或聚合物基质，形状规则或不规则，主要来源于化妆品、药品中的聚乙烯（PE）、聚丙烯（PP）和聚苯乙烯（PS）等，同时现有塑料的降解也会产生二次 MPs。因其来源多样，表面化学性质不同，MPs 在环境中呈现出多种形状和尺寸，如颗粒、纤维和碎片等，且极难控制。

MPs 已广泛渗透到地球的各类生态系统中，从海底峡谷到珠穆朗玛峰顶峰都有它们的踪迹。废水更是成为 MPs 和其他人为废弃物的重要储存库，MPs 凭借其微小尺寸、浮力和疏水性，能够在废水处理过程中存活并扩散到周围环境，在水生环境的沉积物和地表水中积累，进而与周围生物相互作用，对人类健康产生潜在影响。

与此同时，全球范围内细菌对抗生素的耐药性（AMR）问题日益严重。AMR 的产生受到多种因素影响，包括抗生素的过度使用与滥用、卫生条件差以及废水中抗生素残留造成的环境污染等。近年来研究发现，MPs 可能在 AMR 发展中发挥重要作用，它能够通过生物膜形成，容纳微生物群落、化学污染物以及含有抗菌耐药基因（ARGs）的遗传物质，ARGs 可在细菌群落中通过水平基因转移传递给致病菌。然而，目前对于 MPs 的性质（组成、大小、浓度等）如何影响 AMR 发展，以及它们与不同抗生素之间的相互作用，了解还十分有限。

在感染率高且塑料废弃物多的地区，如资源匮乏地区，理解 AMR 与 MPs 之间的相互作用尤为关键。这些地区传染病治疗困难，加上废水处理不足，可能导致 MPs 浓度升高，进而使弱势群体中 AMR 病例增加。因此，深入探究 MPs 与 AMR 发展的基本相互作用迫在眉睫。本研究旨在探讨不同 MPs 特征，包括浓度、表面组成、大小和表面积，对大肠杆菌（Escherichia coli）体外对氨苄青霉素、环丙沙星、强力霉素和链霉素耐药性发展的影响。这些抗生素属于广谱抗生素，代表不同类别，且常见于废水系统。研究重点考察 MPs 各特征对细菌生长、抗生素特异性 AMR 以及多药耐药性（MDR）的影响，并探究 AMR 发展差异背后的潜在机制，尤其是生物膜形成机制。研究结果有助于理解废水监测数据，为废物管理和疾病负担研究提供重要参考。

材料与方法

1. 菌株和培养条件：实验选用E. coli MG1655（ATCC 700926）。所有液体培养均在溶原肉汤（Miller，LB）培养基中，于 180 rpm、37°C 振荡培养。实验开始前，先将 MPs 加入培养基中 48 h，使生物膜充分附着并成熟，之后再添加亚抑制水平的氨苄青霉素、环丙沙星、强力霉素和链霉素。
2. 生长曲线数据：将野生型（WT）E. coli MG1655 在含有不同浓度（100、500、1,000、2,000、4,000、5,000、10,000 和 15,000 个塑料 /μL）10 μm 直径 PS 球体的 LB 培养基中培养，分别在 0、1 和 24 h 取样。样品一式三份接种在 LB 琼脂平板上，测定不同时间点的菌落形成单位（CFU/mL）。为补偿附着在 MP 表面的细胞，在涡旋前后分别进行平板接种，培养 24 h 后计数 CFU。
3. 抗生素和 MP 敏感性测试：为确定细菌的初始基线最低抑菌浓度（MIC），先将细胞在含有微粒（MPs 或玻璃）的无药培养基中振荡培养，直至通过共聚焦显微镜观察到大量生物膜生长（约 48 h）。同时设置未添加 MPs 的细胞作为对照。将微粒涡旋 1 min 并离心，使表面生物膜释放，此时培养液中同时含有生物膜和浮游细胞。采用肉汤微量稀释法在 96 孔板中测定 MIC，具体操作是将含有抗生素的培养基 100 μL 进行两倍稀释至下一列，再取 10 μL 样品细胞加入各孔，在 37°C 静态培养箱中培养 24 h，随后用分光光度计在 600 nm 处测定光密度，并与阴性对照（LB）比较。在传代实验中，每 24 h 测量一次 MIC。
4. MP - 抗生素传代实验：为测试长期暴露于 MPs 对耐药性的影响，设置不同处理组，分别在含有 MPs、抗生素、MPs 和抗生素的培养基中传代细胞，同时设置仅含培养基的对照组。对于对照组和仅含抗生素组，在初始 48 h 生长后，将饱和液体培养物（达到生长极限的培养物）每天以 1:100 的比例稀释到新鲜的含抗生素或不含抗生素的培养基中，标记为传代实验的第 0 天。抗生素添加量为第 0 天测量的初始 MIC 的 40%，处于亚抑制水平。对于含有 MPs 的实验组，在第 0 天计算 MIC 时包含生物膜细胞。在 MPs 实验组中，每次 24 h 暴露后，涡旋样品使部分生物膜细胞释放到上清液中，然后将 MPs 离心（若为 10 μm）或静置（5 - 10 min）使 MPs 沉淀，取上清液（保留 40 μL 用于传代和 MIC 测定），再向含有剩余生物膜的 MPs 的同一培养管中加入 4 mL 新鲜培养基和 40 μL 上清液，整个实验过程中生物膜和浮游细胞始终在同一 MPs 上进行传代。所有组每 2 天进行一次抗生素敏感性测试。
5. 生物膜和浮游细胞特异性敏感性测试：为测定仅浮游细胞或仅生物膜细胞（附着在 MP 表面的细胞）的 MIC 变化，对上述连续传代实验进行改进。将 WT 细胞与 40 个 MP/mL（500 μm 直径 PS 球体）在 37°C 振荡培养 48 h，去除未附着细胞的上清液，其 MIC 作为 “浮游细胞” 的基线 MIC。向剩余 MPs 中加入新鲜无细胞培养基，涡旋后去除含有释放生物膜细胞的上清液，其 MIC 作为 “生物膜细胞” 的基线 MIC。在后续实验中，浮游细胞的上清液（涡旋前）每天转移到含有新鲜 MPs 的新鲜培养基中；生物膜细胞则每天去除上清液，将 MPs 重悬于新鲜培养基中涡旋，释放的生物膜细胞用于 MIC 测定，涡旋后的样品不再回加至实验体系。在测定细胞 MIC 时，浮游细胞直接取当天的上清液，生物膜细胞则通过取出上清液，将 MPs 重悬于 1 mL 新鲜培养基中涡旋释放细胞，取 350 μL 细胞悬液测量光密度（OD）。由于浮游细胞和生物膜细胞浓度不同，需将浮游细胞培养物稀释至与生物膜细胞 OD 值一致，再进行 MIC 测定。
6. 共聚焦激光扫描显微镜（CLSM）图像采集与分析：利用共聚焦显微镜观察粒子表面的细胞。从敏感性测试实验的培养物中随机选取 500 μm 直径 PS 球体，按照 LIVE/DEAD BacLight 细菌活力检测试剂盒的操作说明进行染色。SYTO 9 用于分析活细胞，因为它能穿透所有细菌细胞膜；碘化丙啶用于计数死细胞，因其只能进入细胞膜受损的细胞。将每个塑料球放入含有 1 mL 无菌水的离心管中，加入 3 μL 染色溶液（每种染料各 1.5 μL），在室温下避光孵育 20 min。染色后的样品用倒置 CLSM（Olympus DSU 旋转盘共聚焦显微镜），以 10× 油浸物镜进行成像。先分别对单独用碘化丙啶和 SYTO 9 染色的样品进行分析，确保信号清晰无重叠。将粒子从染料中取出，悬浮在 Costar 透明圆底 96 孔板中进行成像，以保持 MP 形状。找到样品并调整亮度参数后，对每个样品进行 z 轴层扫，获取生物膜活力的三维可视化图像，扫描从球形粒子生长起始的底部开始，到顶部结束。使用 FIJI 软件对 z 轴层扫数据进行分析，将显微镜采集的.oir 文件原始数据的红色和绿色通道合并，生成三维渲染图，再通过 “图像 -> 堆栈 -> z 投影”，选择 “最大强度” 投影类型对堆栈进行合并，进一步分析图像。
7. 生物膜形成与结晶紫染色：将E. coli接种到 3 - 5 mL 培养基中，培养至稳定期（24 h）。次日，在无菌、未处理的 24 孔板中每孔加入 400 μL LB 培养基，接种细菌后覆盖培养板，在 37°C 静置培养 48 h。培养结束后，按照 Merritt 等人的方法进行结晶紫染色，用分光光度计在 500 - 600 nm 波长处测量孔内光密度（OD），以此定量生物膜形成情况。
8. 运动性测定：按照 Partridge 和 Harshey 的方法制作 0.3% 琼脂平板，平板厚度保持一致（20 mL），制作完成后晾干 1 h。用 P20 移液器吸取 5 μL 菌液，插入琼脂约一半深度后缓慢滴加。将平板在 30°C 培养 20 h 后，用直尺测量细胞可见生长区域的径向运动直径（单位：cm），以此评估细菌的运动性。
9. 统计分析：采用单因素方差分析（ANOVA）评估 MIC 倍数变化的显著性。在进行 ANOVA 之前，使用 Shapiro - Wilk 检验对残差进行正态性检验，确保数据符合高斯分布。将每个变量与对照组均值进行比较，对照组根据研究内容不同而有所变化。采用 Dunnett 检验进行多重比较，并相应调整P值。最后，通过 Brown - Forsythe 和 Bartlett 检验对残差的方差齐性和潜在聚类进行检验。选择单因素方差分析是因为在残差呈正态分布的假设下，它可用于比较不同组间的平均 MIC 倍数变化，而 Shapiro - Wilk 检验证实了该假设。Dunnett 检验适用于将每组与对照组进行比较，能有效控制 I 型错误。Brown - Forsythe 和 Bartlett 检验则用于评估方差齐性，保证 ANOVA 结果的可靠性。

结果

1. MPs 在高浓度时影响细菌生长：将E. coli与 8 种不同浓度的 10 μm 直径 PS 球体 MPs 共同培养 18 h，以探究 MPs 对细菌生长的影响。在培养 1 h 后，不同浓度 MPs 处理组与野生型（WT）之间细菌生长无显著差异；但培养 24 h 后，10,000 和 15,000 个 MP/μL 的处理组 CFU/mL 显著低于 WT。值得注意的是，24 h 时涡旋样品的 CFU 计数更高，这表明 MPs 表面存在附着细胞，共聚焦成像结果也证实了这一点。
2. 暴露于 PS MPs 增加多药耐药性：研究人员进一步探究暴露于 MPs 和亚抑制水平抗生素的细菌是否会对其他类抗生素产生耐药性，从而成为多药耐药菌。实验选用了氨苄青霉素（β - 内酰胺类抗生素）、环丙沙星（氟喹诺酮类）、强力霉素（四环素类）和链霉素（氨基糖苷类）这 4 种常见于环境中的抗生素。首先，测量单独培养于含有 MPs（500 μm 直径 PS 球体，因其易于传代）培养基中的细胞 MIC 变化，以确定在无抗生素存在时 MPs 对 AMR 的影响。结果显示，与不含 MPs 的培养基相比，含有 MPs 的培养基中细菌对上述所有抗生素的耐药性均显著增加。在 10 天的实验中，与第 0 天相比，传代后的 MPs 样品中细胞对环丙沙星、强力霉素和链霉素的 MIC 在第 10 天几乎提高了 100 倍。接着，测量在含有或不含有 MPs（500 μm 直径 PS 球体）的情况下，单独使用亚抑制水平抗生素培养的细胞 MIC。结果表明，几乎所有抗生素在添加 MPs 后，细菌的 AMR 均有所增加。例如，在相同抗生素培养条件下，添加 MPs 的培养基中细菌的 MIC 比仅含抗生素的培养基中至少高出 5 倍。其中，环丙沙星与 MPs 共同培养的细菌表现出更高水平的 MDR，其耐药性可达仅用抗生素培养的对照组的 171 倍。此外，链霉素与 MPs 共同培养的细菌对环丙沙星、强力霉素和链霉素均产生了极高水平的耐药性。在停止亚抑制抗生素暴露 5 天后，对细菌进行检测发现，在 16 种实验条件中，81.25%（13/16）在 MPs 和亚抑制抗生素中培养的细菌对相应抗生素保持或增加了耐药性；43.75%（7/16）仅在 MPs 中培养的细菌保持或增加了耐药性；而仅在亚抑制抗生素中培养的细菌，只有 18.75%（3/16）保持了耐药性，且其中两种稳定耐药的条件是在强力霉素中培养。
3. 不同塑料特性（浓度和大小）对耐药性无显著影响：为探究不同 MPs 特征（浓度和大小）对抗生素耐药性的影响，实验以环丙沙星为研究对象，因其在上述研究中耐药性变化最为显著。在亚抑制环丙沙星条件下，研究 MPs 浓度对环丙沙星耐药性发展的影响。分别使用 500 μm 直径 PS 球体（40 和 100 个 MP/mL）和 10 μm 直径 PS 珠子（1,000、500、100 和 10 个 MP/μL），结果发现各 MPs 浓度处理组与不含 MPs 的对照组（仅含亚抑制水平环丙沙星）以及 WT 相比，环丙沙星 MIC 倍数变化均有显著差异；但不同 MPs 浓度之间，环丙沙星 MIC 变化无显著差异。不过，较大直径珠子的绝对 MIC 值最高可达 3.713 ± 0.66 μg/mL 环丙沙星，超过临床和实验室标准协会（CLSI）定义的临床断点（1 μg/mL）三倍以上；较小珠子的绝对 MIC 值最高为 2.508 ± 4 μg/mL 环丙沙星。研究还考察了 PS MPs 大小和表面积对 MIC 的影响，选用 5 μm（100 个 MP/μL）、10 μm（100 个 MP/μL）和 500 μm（40 个 MP/μL）直径的球体，结果表明不同大小 MPs 之间 MIC 差异无统计学意义，但含有 MPs 和抗生素的细胞绝对 MIC 值始终高于仅含抗生素的对照组和 WT，且均高于临床断点。
4. 塑料成分影响抗生素耐药性：研究不同塑料成分对环丙沙星耐药性发展和程度的影响，对比了 PS、PE 和 PP 这三种常见塑料类型。实验结果显示，暴露 10 天后，所有不同 MP 成分处理组的 MIC 均显著高于仅暴露于亚抑制水平环丙沙星的 MPs-free 对照组。PS 样品的绝对 MIC 值（1.65 ± 0.572 μg/mL）与 PE（0.743 ± 0.36 μg/mL）、PP（0.528 ± 0.162 μg/mL）以及仅环丙沙星对照组（0.20625 ± 0.04 μg/mL）有显著差异，且 PS MPs 的绝对 MIC 值高于环丙沙星 - E. coli临床断点（1 μg/mL）。有趣的是，三种塑料样品的 AMR 增长速率在倍数变化方面相似。
5. PS 相比玻璃更易增加耐药性和生物膜形成：比较 PS MP 和玻璃球体（500 μm 直径，40 个 MP/μL）对耐药性发展的差异，以确定塑料底物是否具有特殊作用。实验中，微粒均暴露于亚抑制水平环丙沙星，并与仅含亚抑制环丙沙星的对照组比较。结果显示，10 天研究结束时，PS 塑料球体的绝对 MIC 值显著高于玻璃球体和抗生素对照组；不过，二者的耐药性增长倍数变化无统计学差异。通过共聚焦显微镜观察发现，玻璃表面的细菌生长量明显减少，且大部分为死细胞；而 PS 表面则布满活细胞，细菌在其表面均匀定植。这表明 PS 比玻璃更有利于细菌形成生物膜，进而导致更高的耐药性。
6. 暴露于 MPs 会筛选出更易形成生物膜的细菌：观察到 PS MPs 表面形成了大量生物膜后，进一步探究生物膜在其中的作用。利用结晶紫染色法检测生物膜形成情况，该方法可使生物膜可见并定量。将在含或不含 MPs、不同抗生素及对照组中培养 10 天的细菌，去除 MPs 和痕量抗生素后，在 24 孔 PS 培养板中培养 48 h，用 0.1% 结晶紫溶液定量生物膜形成。同时，采用 0.3% 软琼脂平板法检测细菌的游泳运动性，因为细菌运动性与生物膜形成密切相关，运动性受损通常与生物膜形成增加有关。结果显示，所有含 MPs 培养的样品生物膜生长均显著高于不含 MPs 的样品，表现为更高的 OD 读数和更多染色的表面附着细胞；而不含 MPs 培养的细菌运动直径显著大于含 MPs 培养的细菌，表明暴露于 MPs 的细菌运动性受损。为评估生物膜和浮游细胞对 AM