肉鸡垫料湿度与微量金属：携带铁载体大质粒沙门氏菌持续存在的 “幕后推手”

《Applied and Environmental Microbiology》：Broiler litter moisture and trace metals contribute to the persistence of Salmonella strains that harbor large plasmids carrying siderophores

本文研究肉鸡垫料中沙门氏菌（Salmonella）生态。通过对两个商业肉鸡舍垫料采样分析，发现垫料湿度和微量金属影响 Salmonella 的存活，携带铁载体大质粒的菌株占主导。该研究为控制 Salmonella 提供新视角，对保障禽肉安全意义重大。

　　### 研究背景
沙门氏菌（Salmonella）感染常与家禽消费相关。尽管美国实施关键绩效指标后，收获后鸡肉样本中 Salmonella 检测阳性数减少，但沙门氏菌病总体发病率未变。美国食品安全检验局（FSIS）提出在收获前控制 Salmonella 负荷的监管框架，但目前缺乏准确测定鸡胴体或环境基质中 Salmonella 负荷的方法。肉鸡垫料采样是检测 Salmonella 感染鸡群的实用方法，研究 Salmonella 在垫料中的生态学，对了解其传播和控制具有重要意义。

材料和方法

1. 研究设计：在 2021 年 5 月至 2022 年 3 月期间，于两个相邻的商业肉鸡舍中连续饲养四批肉鸡，使用回收垫料作为 bedding material，在批次间进行机械清理和施用铝硫酸盐（alum）处理。
2. 垫料采样：在鸡生长的不同阶段（4 - 14 天和 32 - 38 天）及批次间的停机期（alum 施用前后）采集垫料样本，每个鸡舍分多个区域采样，共获得 224 个 pooled litter samples。
3. 垫料处理与 Salmonella 分离：采用选择性培养富集技术从垫料样本中分离 Salmonella，通过一系列培养步骤，将疑似菌落接种到不同培养基上，最终保存 Salmonella 阳性样本中的菌株。
4. 定量 PCR 测定 Salmonella 丰度：提取垫料样本 DNA，利用定量 PCR（qPCR）检测总肠杆菌科（以 gapA 为靶基因）、Salmonella enterica（以 ttr_BCD为靶基因）和 S. Infantis（以 usg 为靶基因）的基因拷贝数，计算 Salmonella 相对丰度。
5. Salmonella 分离株的药敏试验和血清分型：采用肉汤微量稀释法测定 Salmonella 分离株对抗生素的敏感性，将菌株送实验室进行血清分型。
6. Salmonella 分离株的全基因组测序和生物信息学分析：对部分 Salmonella 分离株进行长读长和短读长测序，使用多种工具进行基因组注释、抗性基因和毒力因子鉴定，并构建系统发育树。
7. 垫料 pH、湿度和营养成分测定：通过烘干法测定垫料湿度，用 pH 计测量垫料洗脱液 pH，采用特定方法分析垫料中的营养成分。
8. 使用机器学习模型预测 Salmonella 检测结果：选择七种机器学习分类器，以垫料细菌和理化参数为特征，进行数据预处理、超参数调整、模型比较评估和特征重要性分析，构建预测 Salmonella 存在与否的模型。
9. 铁限制和铜富集条件下的生长实验：选取八种 Salmonella 菌株，在不同培养基（LB、LB 添加酸化 CuSO₄、LB 添加铁螯合剂和酸化 CuSO₄、LB 添加铁螯合剂）中培养，测定菌株生长情况。
10. 在病原体检测数据库中鉴定 SNP 簇：搜索 NCBI 病原体检测数据库（GenomeTrakr），获取与研究中 Typhimurium 分离株相关的 SNP 簇元数据和基因组组装文件。
11. 统计分析：对数据进行 log₁₀转换后，使用多种统计方法（Fisher 精确检验、Mann - Whitney 检验、Kruskal - Wallis 检验、Spearman 相关检验、简单逻辑回归等）分析差异和相关性。

结果

1. 垫料中 Salmonella 的流行率和丰度：总体上，垫料样本中 Salmonella 流行率为 48.6%，鸡群存在时（grow - out）流行率（76%）显著高于停机期（12.5%）。Salmonella 丰度在不同批次和 grow - out 与停机期之间存在显著差异，且与鸡群年龄无关。
2. Salmonella 血清型和抗生素抗性谱：分离株分为九种血清型，Typhimurium、Kentucky 和 Infantis 占多数。不同鸡舍血清型分布存在显著差异，Infantis 和 Typhimurium 分离株表现出不同的抗生素抗性模式。
3. Salmonella 分离株的基因组多样性：测序结果显示，Infantis、Typhimurium 和 Kentucky 分离株分别属于不同的多位点序列类型（MLSTs）和核心基因组 MLST（cgST），各血清型分离株间单核苷酸多态性（SNP）差异不同。
4. Salmonella 基因组中的抗菌抗性决定因素：Infantis 分离株携带较多抗菌抗性基因（ARGs），位于大质粒 IncFIB (pN55391) 上；Typhimurium 和 Kentucky 分离株的 ARGs 分别位于 IncC 和 IncH12A 等质粒上。
5. Salmonella 基因组中可传播适应性因子的遗传背景：三种血清型均含有多种毒力基因（VGs），Infantis 和 Typhimurium 携带编码 yersiniabactin 的 VGs，Kentucky 携带编码 aerobactin 的 VGs，相关基因位于不同质粒上。
6. 使用机器学习预测 Salmonella：决策树分类器在预测 Salmonella 培养阳性或阴性方面最有效，垫料结块部分的湿度、ttr/gapA 比值和 gapA 丰度是影响模型预测的主要变量。
7. 垫料湿度与营养成分的相关性：垫料湿度与磷、铁和铜浓度相关，湿度增加时，铁浓度降低，磷和铜浓度升高。低铁水平的垫料样本更易检测到 Salmonella。
8. 铁和铜暴露对 Salmonella 适应性的影响：在铁限制和铜富集条件下，不同 Salmonella 菌株生长表现不同，Typhimurium 菌株在某些条件下生长较好，表明微量营养素影响菌株生长。
9. 从鸡肉样本中分离的 Typhimurium 基因组中携带 Ybt 的 IncC 质粒的存在：在 NCBI 数据库中搜索发现，来自鸡肉样本的 Typhimurium 基因组中，携带 Ybt 的 IncC 质粒较为常见。

讨论

1. 检测方法的优势与局限：qPCR 方法可有效测定 Salmonella 基因丰度，但仅靠基因丰度不能确定样本是否培养阳性。将基因丰度纳入机器学习模型可提高预测准确性。
2. 血清型和基因特征：研究中发现的主要血清型与其他研究一致，不同血清型在不同批次中的分布差异可能与多种因素有关，如竞争、疫苗接种或鸡群来源。
3. 抗性基因和毒力因子：Typhimurium 和 Infantis 的某些特征表明，相关抗性基因和毒力因子可能在其生存和传播中起重要作用，如 IncC 质粒上的 Ybt 编码基因。
4. 垫料湿度的影响：垫料湿度是影响 Salmonella 在垫料中生存的关键因素，较高湿度增加了检测到可培养 Salmonella 的可能性，可能通过影响营养成分的生物利用度来实现。

结论

本研究表明 Salmonella 在肉鸡垫料中持续存在，Typhimurium 和 Infantis 是主要血清型。铁和铜影响携带大共轭质粒的菌株生长，垫料湿度是预测可培养 Salmonella 存在的重要因素，为农场监测 Salmonella 提供了有前景的预测模型。但研究存在样本量小和菌株选择有偏差等局限性，未来需更大数据集进行验证。