插入序列对乳酸菌质粒复制的显著影响及新克隆载体的开发

《Applied and Environmental Microbiology》：The insertion of the inverted repeat of an insertion sequence (IS) element from Lacticaseibacillus rhamnosus changes the host range and stability of pGK12, a shuttle vector for lactic acid bacteria

本研究揭示了插入序列（IS）对乳酸菌质粒复制的调控作用，并开发出新的克隆载体，为乳酸菌基因工程提供了重要工具。

　　本研究聚焦于插入序列（IS）对乳酸菌质粒复制的影响，以及基于此开发新的克隆载体。研究发现，插入序列 ISLrh 的插入显著改变了质粒 pGK12 的宿主范围和稳定性，并影响了质粒的拷贝数。通过对 ISLrh 的深入分析，揭示了其末端反向重复序列（IRs）和插入位置对质粒复制能力的关键作用，并基于此开发出适用于乳酸菌的新型克隆载体 pTRK830，为乳酸菌的基因工程提供了有力工具。

研究背景

乳酸菌在益生菌、工业发酵菌株以及各种高附加值化合物和食品配料的生产中发挥着重要作用。由于其健康益处和公认为安全（GRAS）的特性，乳酸菌被认为是工业和治疗应用中理想的基因工程载体。然而，成功的基因工程需要高效的克隆载体来引入、修改或移除目标基因。广泛宿主范围的质粒因其能够在不同系统发育亚群的细菌中稳定复制而备受关注。

质粒的复制机制主要有三种：θ型、滚环复制（RCR）和链置换型。大多数革兰氏阳性菌来源的质粒通过滚环复制机制进行复制。例如，pWVO1 是一种从乳酸乳球菌中分离出来的 RCR 质粒，包含单链起源（sso）、双链起源（dso）以及复制蛋白基因（repA）。基于 pWVO1 的 RCR 起源，开发了许多克隆载体，其中 pGK12 是在乳酸菌基因工程中广泛使用的质粒之一。然而，pGK12 在多种细菌中表现出不稳定性且拷贝数较低。

插入序列（IS）是细菌基因组中的关键组成部分，广泛分布于细菌基因组中。IS 元件由一个转座酶基因组成，该基因催化其转座，并被末端反向重复序列（IRs）所包围。IS 元件能够显著促进突变、基因失活、基因过表达和染色体重排等事件的发生。

研究方法与实验

本研究中，研究人员首先尝试将 pGK12 转化到乳酸乳球菌 M1 中，但未能成功。然而，他们意外地发现了一个比 pGK12 大的转化子，命名为 pTRK829。序列分析显示，pTRK829 中插入了一个来自乳酸乳球菌 M1 基因组的 IS 元件 ISLrh，该元件插入在 sso 上游 282 bp 处。ISLrh 长度为 857 bp，属于 IS5 家族中的 IS1031 亚群，包含两个 17 bp 的末端反向重复序列（IRs），序列分别为 5′-GAACCTGTCTAGTATCT-3′。ISLrh 还包含两个部分重叠的开放阅读框（ORFs），orfA 和 orfB，通过 -1 移码产生全长转座酶。

进一步的实验发现，pTRK829 在乳酸乳球菌 M1 中的转化效率为 10³–10⁴ CFU/μg，而 pGK12 则无法转化。此外，pTRK829 还能够在乳酸乳球菌 GG（LGG）、乳酸乳球菌 casei ATCC 393 和乳酸乳球菌 paracasei ATCC 25598 中复制，而这些菌株也无法被 pGK12 转化。然而，pTRK829 不稳定，会发生自发缺失，形成更小且更稳定的变体 pTRK830，该变体保留了 ISLrh。

插入序列对质粒宿主范围和稳定性的改变

研究人员测试了 pGK12 及其变体 pTRK829 和 pTRK830 在 10 种常用的乳酸菌菌株中的复制能力。结果显示，ISLrh 的插入显著改变了质粒的宿主范围。pTRK829 和 pTRK830 能够在 LGG、乳酸乳球菌 casei ATCC 393 和乳酸乳球菌 paracasei ATCC 25598 中成功转化并复制，而 pGK12 则不能。此外，在乳酸乳球菌 paracasei ATCC 334 中，ISLrh 的插入显著提高了转化效率，从 pGK12 的约 10¹ CFU/μg 提高到 pTRK829 或 pTRK830 的 10³–10⁴ CFU/μg。

在质粒稳定性方面，pTRK829 在 LGG、乳酸乳球菌 casei ATCC 393 和乳酸乳球菌 paracasei ATCC 25598 中表现出较差的稳定性，而 pTRK830 则更为稳定。这表明质粒的稳定性可能与其大小有关。在乳酸乳球菌 paracasei ATCC 334 中，ISLrh 的插入提高了 pGK12 的稳定性，而在乳酸乳球菌 gasseri ATCC 33323 中，ISLrh 的插入对质粒稳定性没有影响，所有三种质粒都表现出极不稳定的特性。在乳酸乳球菌 johnsonii ATCC 11506 中，pGK12 略微比其 ISLrh 插入变体更稳定。

插入序列对宿主生长的影响

在稳定性实验过程中，研究人员观察到潜在的生长差异，表明载体可能对宿主菌株施加了显著的代谢负担。通过测定乳酸乳球菌 paracasei ATCC 334、乳酸乳球菌 gasseri ATCC 33323 和乳酸乳球菌 johnsonii ATCC 11506 中 pGK12、pTRK829 和 pTRK830 转化子的最大生长速率，发现 ISLrh 的插入对宿主生长的影响因菌株而异。在乳酸乳球菌 paracasei ATCC 334 中，pGK12 的存在显著降低了菌株的生长速率，而 pTRK829 和 pTRK830 的影响较小。这表明 ISLrh 的插入可能减轻了质粒在该宿主中的代谢负担。然而，在乳酸乳球菌 johnsonii ATCC 11506 中，ISLrh 插入变体（pTRK829 和 pTRK830）的生长速率显著低于无质粒对照组，而 pGK12 则没有显著差异，这表明 ISLrh 的插入可能在该菌株中增加了代谢负担。

插入序列对质粒拷贝数的影响

研究人员还评估了 pGK12 及其变体在六种菌株中的质粒拷贝数（PCN）。结果显示，不同菌株和质粒之间的 PCN 存在较大差异。具体而言，pTRK829 和 pTRK830 在 LGG 中为低拷贝数质粒（每细胞少于 5 个拷贝），在乳酸乳球菌 casei ATCC 393 中为高拷贝数质粒（每细胞 20 个或更多拷贝），在乳酸乳球菌 paracasei ATCC 25598 中为中等拷贝数质粒（每细胞约 10 个拷贝）。在乳酸乳球菌 paracasei ATCC 334 中，ISLrh 的插入导致 PCN 增加，pTRK829 和 pTRK830 的拷贝数显著高于 pGK12。在乳酸乳球菌 gasseri ATCC 33323 中，尽管所有三种质粒都不稳定，但它们都是高拷贝数质粒。在乳酸乳球菌 johnsonii ATCC 11506 中，ISLrh 插入质粒（pTRK829 和 pTR