利用木质纤维素碳源生产异戊烯醇的恶臭假单胞菌底盘开发

《Applied and Environmental Microbiology》：Alternate routes to acetate tolerance lead to varied isoprenol production from mixed carbon sources in Pseudomonas putida

该研究优化恶臭假单胞菌（P. putida）菌株利用葡萄糖 - 乙酸混合碳源生产异戊烯醇，解析其分子机制。

　　

引言

2023 年美国能源部 “十亿吨报告” 指出，美国每年产生超 11 亿吨植物源生物质。这些生物质若被有效利用，可成为可再生能源的丰富来源，助力减少化石燃料使用产生的温室气体排放，实现航空、铁路和汽车等行业的脱碳。从植物生物质中提取的半纤维素和纤维素成分主要包含葡萄糖、木糖和乙酸，其中葡萄糖已大规模用于微生物生物转化生产乙醇。然而，像异戊烯醇（3 - 甲基 - 3 - 丁烯 - 1 - 醇）这类具有优势特性的新兴分子，有望推动生物基工艺在更多领域应用，比如航空领域，或者用于生产可回收性更好的塑料。充分利用生物质中的各类碳源，有助于降低生产成本，对生物转化工艺的经济竞争力和商业应用至关重要。

乙酸在许多木质纤维素碳流中含量相对丰富，其浓度因生物质来源和预处理方法而异，通常在 0.5% - 17%（wt/wt）之间。尽管乙酸是许多工业微生物的天然底物，但因其在较高浓度和进料速率下会抑制微生物生长，常被视为生物质预处理的不良副产物而被忽视。不过，已有研究探索了在大肠杆菌（E. coli）中利用乙酸作为替代碳源生产伊康酸、异丁醇和琥珀酸等分子的可行性。

异戊烯醇作为一种有潜力的生物燃料和商品化学品，可作为柴油混合原料，或催化升级为可持续航空燃料（SAF）混合原料 1,4 - 二甲基环辛烷（DMCO）。在恶臭假单胞菌（P. putida）中生产异戊烯醇，除了需要引入异源生产途径外，还需敲除其异戊烯醇分解代谢途径。研究发现，敲除P. putida KT2440 中的 PP_2675 基因，可提高异戊烯醇产量，该基因编码的细胞色素 C 型蛋白参与吡咯喹啉醌（PQQ）的再生，而 PQQ 是醇脱氢酶活性所需的辅助因子。

本研究以已发表的P. putida ΔPP_2675 Δ14-PP_2676 菌株（简称 “PT”）为研究对象，探究其在混合葡萄糖 - 乙酸碳源上的生长和异戊烯醇生产情况。通过筛选获得乙酸耐受性提高且能利用混合碳源生产异戊烯醇的突变菌株，并利用蛋白质组学深入解析其潜在机制，为木质纤维素生物质中乙酸在异戊烯醇转化流程中的共利用奠定基础。

材料与方法

菌株和质粒

本研究使用的菌株包括P. putida KT2440 野生型（WT）、PT（P. putida KT2440 ΔPP_2675 Δ14-PP_2676）以及通过耐受化筛选获得的 Σ 类菌株（如 Σ1、Σ2、Σ3、Σ4、Σ5）等。质粒 pIY670 用于异戊烯醇的异源生产，其携带优化的 IPP 旁路途径，受阿拉伯糖诱导启动子调控，并含有卡那霉素抗性筛选标记。采用 Cpf1 介导的单链 DNA 重组技术构建缺失菌株，通过表达显性负突变体mutL-E36K抑制内源性 DNA 错配修复系统，增加自发突变频率。对选定样本进行全基因组测序（WGS）时，使用 GenElute Bacterial Genomic DNA Kit 提取基因组 DNA，在 Illumina NovaSeq X Plus 测序仪上进行 2 × 151 bp 双端测序，利用 Geneious 软件进行序列比对和变异检测。

培养条件

常规培养时，将保存于 - 80°C 的冻存菌接种到固体 LB 琼脂平板上，30°C 培养过夜。挑取单菌落接种到 5 mL 液体 LB 培养基中，30°C、200 rpm 振荡培养 24 h（除筛选质粒时添加相应抗生素外，一般不添加抗生素）。P. putida的耐受化及后续表型表征实验使用 M9 基本盐培养基，该培养基含有 1× M9 盐（2 g/L (NH₄)₂SO₄、6.8 g/L Na₂HPO₄、3 g/L KH₂PO₄、0.5 g/L NaCl）、2 mM MgSO₄、0.1 mM CaCl₂和微量元素溶液。实验中常用 50 mM（~0.3% wt/vol）乙酸钠或 1%（wt/vol）葡萄糖作为单一碳源，根据需要添加异戊烯醇。

PT 对乙酸和异戊烯醇的耐受化

从新鲜琼脂平板上挑取 PT 单菌落，在 LB 培养基中培养。次日，将饱和培养物以 1:100 的比例稀释到 25 mL M9 乙酸培养基中进行初始乙酸驯化，培养 24 h 后，离心收集细胞，重悬于新鲜 M9 乙酸培养基中，再将细胞悬液稀释至 OD₆₀₀为 0.01，接种到含有不同浓度异戊烯醇（7 g/L、8 g/L、9 g/L）的 M9 乙酸培养基中，分装到 24 孔深孔板中培养。当培养基出现浑浊（通常接种后 2 - 3 天），取菌液涂布到 LB 琼脂平板上分离单菌落。对分离得到的单菌落再次进行耐受化培养，用更高浓度异戊烯醇（10 g/L、11 g/L）筛选，确保获得真正耐受的菌株，将筛选得到的菌株保存用于表型分析。对于表达重组质粒的批次，先将新鲜转化的细胞在含有重组质粒的 LB 培养基中培养，用 1 mM 3 - 甲基苯甲酸诱导重组酶表达，后续按上述耐受化步骤进行实验。

生长动力学测定

采用微孔板培养方式评估细胞在不同条件下的生长曲线。将饱和 LB 培养物先在 M9 葡萄糖培养基中 1:100 稀释培养过夜，次日将饱和培养物稀释至 OD₆₀₀为 1.0/mL，再 1:100 稀释到含有不同碳源的 M9 培养基中，在 48 孔微孔板中密封培养。使用 Molecular Devices m2E Plate Reader 在 30°C、持续振荡条件下每隔 15 min 读取数据，实验设置至少三个生物学重复和两个技术重复，使用 R 语言中的 mipreadr v0.1 工作流程分析数据。

蛋白质组学分析

挑取新鲜菌落接种到 5 mL LB 培养基中培养，经 M9 葡萄糖培养基适应后，收集细胞并洗涤，将细胞悬液分别接种到 M9 乙酸、M9 葡萄糖或 M9 葡萄糖 - 乙酸培养基中，培养至对数生长期（OD₆₀₀为 0.6 - 0.8）时收集细胞。按照既定的蛋白质组学样品制备方案提取蛋白质并制备胰蛋白酶肽段，将肽段样品加载到 Ascentis ES - C18 柱上，通过梯度洗脱后进入质谱仪进行数据独立采集（DIA）模式检测。使用 DIA - NN 软件分析数据，搜索数据库为P. putida KT2440 最新的 Uniprot 蛋白质组 FASTA 序列和常见蛋白质污染物，对输出报告进行筛选和分析。

底物消耗测量

挑取新鲜菌落接种到 5 mL LB 培养基中培养，次日将细胞在 M9 葡萄糖 2%（wt/vol）培养基中 1:100 稀释培养 24 h，收集细胞洗涤后，接种到含有不同碳源（M9 葡萄糖 2%（wt/vol）、M9 乙酸 50 mM（~0.3% wt/vol）、M9 葡萄糖 2%（wt/vol）和乙酸 0.65%（wt/vol））的培养基中培养。在不同时间点取样，通过浊度（OD₆₀₀）测量细胞生长情况，使用高效液相色谱（HPLC）测定上清液中乙酸和葡萄糖浓度。

异戊烯醇生产实验

将含有异戊烯醇生产质粒 pIY670 的不同基因型菌株新鲜菌落接种到含有卡那霉素的 LB 培养基中培养，饱和过夜培养物在 M9 葡萄糖 2%（wt/vol）培养基中 1:100 稀释培养一天进行基本培养基适应。将细胞洗涤后，接种到含有葡萄糖 2%（wt/vol）或葡萄糖 2%（wt/vol）和乙酸 0.65%（wt/vol）的 M9 培养基中，添加阿拉伯糖诱导异戊烯醇生产途径，在不同时间点取样，通过浊度测量细胞生长，使用气相色谱 - 火焰离子化检测器（GC - FID）测定异戊烯醇浓度。

结果

初始异戊烯醇分解代谢缺陷的P. putida菌株在含乙酸培养基中生长受阻

葡萄糖和乙酸单独或混合作为底物时，均可支持P. putida KT2440 的生长。然而，WT 菌株在混合碳源条件下的生长曲线不如单一碳源条件下理想。PT 菌株在所有碳源条件下的倍增时间均比 WT 菌株长，在以乙酸为唯一碳源时，PT 菌株的延迟期明显延长，比 WT 菌株延迟约 12 h 才出现浊度增加。在单一葡萄糖碳源条件下，WT 和 PT 菌株的底物消耗曲线相似，但在混合碳源条件下，PT 菌株对葡萄糖和乙酸的消耗速率均显著降低。PT 菌株在混合碳源实验中的生长表现出较高的变异性，三个生物学重复中只有一个能够生长，且生长的菌株延迟期超过 30 h，最终 OD₆₀₀值远低于 WT 菌株，与仅以乙酸为碳源时的水平相似。

耐受化使菌株在以乙酸为碳源时的适应性提高

鉴于 PT 菌株在混合葡萄糖 - 乙酸碳源培养基中的生长表型，研究人员在含有乙酸和抑制生长浓度异戊烯醇的培养基中培养 PT 细胞，以筛选在乙酸培养基中生长适应性提高的旁路突变体。经过 3 个月的筛选，从五个独立实验批次中获得了乙酸 / 异戊烯醇耐受的 Σ 类菌株。与 PT 菌株相比，所有 Σ 类菌株在 M9 乙酸培养基中的延迟期显著缩短（从约 48 h 缩短至 6 h），指数生长期的最大生长速率更快，且生物学重复间的生长一致性更好。虽然 Σ 类菌株在含有 2 g/L 异戊烯醇的乙酸培养基中的生长表现略逊于仅含乙酸的培养基，但与 PT 菌株相比，其生长速率仍有显著提高，延迟期明显缩短。在五个 Σ 类菌株中，Σ3 和 Σ4 对不同碳源的适应速度更快，Σ1、Σ2 和 Σ5 在含有乙酸和葡萄糖的培养基中延迟期更明显。对代表性菌株 Σ4 和 Σ5 的底物消耗时间进程分析表明，它们在混合碳源培养基中能够完全消耗葡萄糖和乙酸，克服了 PT 菌株中?PP_2675 突变带来的限制，具备作为生物燃料生物转化宿主的理想特性。

耐受化赋予细胞在基本培养基中不同的异戊烯醇生产能力

将携带异戊烯醇生产途径的质粒转化到所有 Σ 类菌株和 PT 菌株中，在不同碳源条件下进行异戊烯醇生产实验。在 M9 葡萄糖培养基中，PT 菌株在 48 h 时异戊烯醇产量为 283 ± 26 mg/L，但 72 h 时损失约 35%。Σ3 和 Σ4 菌株的异戊烯醇产量略低于 PT 菌株，而 Σ1、Σ2 和 Σ5 菌株的产量较高，其中 Σ5 菌株在 48 h 时产量可达 389 mg/L，且在第三天的产量损失仅为 2.73%。在葡萄糖 - 乙酸混合碳源条件下，PT 菌株无法生长，未检测到异戊烯醇生产，而所有 Σ 类菌株均能生产异戊烯醇，其中 Σ5 菌株在 72 h 时异戊烯醇产量最高，达到 161 ± 12 mg/L。单独以乙酸为碳源时，Σ 类菌株均未检测到异戊烯醇生产，表明乙酸主要用于支持生物量形成，异戊烯醇的形成主要依赖葡萄糖作为碳源。

蛋白质组学揭示耐受化和未耐受P. putida菌株在乙酸和葡萄糖同化途径上的差异

通过蛋白质组学分析，研究人员发现 PT 菌株在乙酸利用的关键步骤上比 Σ 类菌株速率受限，包括乙酸同化和乙醛酸分流的活性。在乙酸培养基中，所有 Σ 类菌株中由 PP_0154（SpcC）编码的蛋白质表达至少增加 2 倍，而 PT 和 WT 菌株中未增加。SpcC 是一种假定的琥珀酰 - CoA：乙酸 CoA 转移酶，可使乙酸通过琥珀酸进入三羧酸（TCA）循环。相比之下，PT 和 WT 菌株在乙酸中可能通过直接生成乙酰 - CoA 的方式将乙酸纳入中心碳代谢，该过程需要 ATP，这可能是它们在乙酸中表现不佳的原因。

P. putida有三种同化葡萄糖的途径，最终均形成 6 - 磷酸葡萄糖酸。研究分析表明，在乙酸存在的情况下，负责通过葡萄糖酸将葡萄糖纳入中心碳代谢的蛋白质（如葡萄糖酸激酶 GnuK（PP_3416）和 2 - 酮葡萄糖酸激酶 KguK（PP_3378））在所有菌株中均受到高度抑制，但葡萄糖激酶（glk，PP_1011）在两种条件下的表达水平相对相似。这可以解释为什么 PT 菌株在混合碳源培养基中虽无法有效消耗乙酸，但葡萄糖水平仍会随时间下降，使细胞能够长时间存活。此外，不同菌株对葡萄糖酸途径的激活差异与它们的底物消耗和异戊烯醇生产表型相关。例如，Σ3 和 Σ4 菌株中该途径的酶受到强烈抑制，而 Σ1、Σ2 和 Σ5 菌株中未受抑制，这表明在乙酸存在下充分利用葡萄糖酸途径消耗葡萄糖，对于在模拟水解液培养基中将碳导向生物燃料生产至关重要。另外，Σ2 和 Σ5 菌株中乙醛酸分流的第一步 —— 异柠檬酸裂解酶（PP_4116）显著上调，这可能为它们提供了更好的资源利用优势。

转录因子和其他非代谢基因在 Σ 类菌株的耐受表型中起重要作用

尽管在乙酸培养基中发现了中央代谢的差异，但 78% 的在 Σ 类菌株与 PT 菌株之间差异表达且达到统计学显著阈值的蛋白质并不属于注释的 KEGG 代谢途径，这表明其他分子效应器可能促进了耐受表型。主成分分析（PCA）显示，菌株在乙酸生长条件下的聚类与它们在含乙酸培养基中的延迟期顺序一致，生长较慢的 PT 和 WT 菌株聚集在一端，生长较快的 Σ3 和 Σ4 菌株聚集在另一端。许多不同的调节变化可能驱动了 Σ 类菌株在乙酸中的生长改善。

通过对 Σ 类菌株和 PT 菌株的蛋白质表达水平进行成对比较，发现了一些与乙酸代谢或菌株适应性相关的潜在蛋白质效应器。例如，除 Σ5 外，所有 Σ 类菌株中的乙酸渗透酶 ActP - I（PP_1743）均下调；Σ3 和 Σ4 菌株中，表面粘附蛋白（PP_0168）下调，未表征的转录调节因子（PP_0673）上调，RelA（PP_1656）强烈下调。所有 Σ 类菌株中，由 PP_0988（GcvP - I）编码的氧化还原酶家族甘氨酸脱羧酶、由 PP_2025 编码的核酸酶 SbcCD 的亚基 D、由 PP_4264（HemN）编码的粪卟啉原 III 氧化酶和由 PP_4872（YgiQ）编码的 UPF0313 蛋白在乙酸培养基中均显著上调。此外，在 Σ1、Σ2 和 Σ5 菌株中，假定的醛缩酶 PP_2037 也上调。

对 PT 菌株和四个代表性 Σ 类菌株进行全基因组重测序，发现 DNA 测序鉴定的突变开放阅读框（ORF）或基因间区域与蛋白质组学数据鉴定的差异表达靶点之间几乎没有重叠。尽管蛋白质组学未检测到非编码序列（如启动子区域）突变导致的蛋白质表达水平变化，但调节因子（如 RelA 和 RpoS）的酶活性或 DNA 结合变化可能对乙酸耐受性提供增量适应性贡献。对表达的转录因子进行层次聚类，证实了 Σ 类菌株的表型分组与之前的表型特征一致。

为进一步探究关键蛋白的作用，研究人员在代表性的 Σ4 和 Σ5 菌株中构建了候选蛋白（如 HemN、GcvP - I 和 PP_2037）的缺失菌株。结果发现，GcvP - I 和 PP_2037 缺失突变体在测试条件下未显著影响生长，而 HemN 缺失突变体在两种菌株中均导致不同程度的适应性缺陷。在 Σ5 菌株背景下，HemN 缺失突变体在仅含乙酸的培养基中生长延迟期延长，在乙酸 - 葡萄糖混合碳源培养基中完全无法生长；在 Σ4 菌株背景下，HemN 缺失突变体在相同培养基条件下生长缺陷较轻微。这表明 HemN 活性可以增强细胞在乙酸和异戊烯醇压力下的生长，是理解该氧化酶与乙酸培养基中生长潜在关系的关键靶点。

讨论

本研究首次利用P. putida，以模拟木质纤维素碳流中底物比例的葡萄糖 - 乙酸混合碳源生产异戊烯醇。乙酸单独作为生物燃料生产的目标并不理想，因其生成异戊烯醇需要复杂的碳链延长步骤。但<