艰难梭菌抗氧化应激机制：肠道致病菌的生存 “密码”

《mBio》：Defense arsenal of the strict anaerobe Clostridioides difficile against reactive oxygen species encountered during its infection cycle

本文揭示艰难梭菌（Clostridioides difficile）应对活性氧（ROS）的解毒酶及调控机制，对理解其感染生存意义重大。

　　### 艰难梭菌抗氧化应激机制：肠道致病菌的生存 “密码”
在肠道这个微观世界里，一场看不见的战争时刻都在上演。艰难梭菌（Clostridioides difficile）作为引发抗生素相关性腹泻的 “罪魁祸首”，在与人体免疫系统的对抗中，进化出了一套独特的生存策略。其中，应对活性氧（ROS）的氧化应激反应，成为了艰难梭菌能够在肠道中 “安营扎寨”、兴风作浪的关键所在。

艰难梭菌：肠道里的 “麻烦制造者”

艰难梭菌是一种严格厌氧的革兰氏阳性芽孢杆菌，在发达国家，它是导致成人医院获得性腹泻的主要病原体。通常情况下，抗生素的使用会打破肠道菌群的平衡，引发菌群失调，为艰难梭菌的滋生创造条件。艰难梭菌的芽孢能够在环境中存活很长时间，一旦进入人体肠道，在适宜的条件下便会萌发为营养细胞。这些营养细胞会释放毒素，如 TcdA 和 TcdB，它们就像 “破坏分子”，能够靶向肠道上皮细胞的小 Rho GTPases，破坏细胞的肌动蛋白细胞骨架，导致细胞脱落、裂解，进而破坏肠道上皮的屏障功能。

不仅如此，毒素的释放和组织损伤还会引发强烈的炎症反应。人体的免疫系统会迅速做出反应，招募大量的中性粒细胞和巨噬细胞到感染部位。这些免疫细胞就像 “战斗卫士”，会释放 ROS，试图消灭艰难梭菌。然而，艰难梭菌却 “不甘示弱”，它必须应对这些 ROS 带来的氧化应激，否则就无法在肠道中生存和繁殖。

ROS：肠道中的 “双刃剑”

ROS 包括超氧阴离子（O₂^??）、过氧化氢（H₂O₂）等，它们在肠道中扮演着 “双刃剑” 的角色。一方面，ROS 是人体免疫系统对抗病原体的重要武器，能够抑制病原菌的生长，维持肠道的稳态；另一方面，高浓度的 ROS 会对细胞造成损伤，影响蛋白质、核酸等生物大分子的功能。

在肠道中，ROS 的来源多种多样。除了免疫细胞分泌之外，肠道微生物群的代谢活动、真核细胞的代谢过程以及宿主介导的免疫反应都可能产生 ROS。在艰难梭菌感染的过程中，免疫细胞释放的 ROS 成为了艰难梭菌面临的主要挑战之一。

艰难梭菌的 ROS 解毒酶 “武器库”

为了应对 ROS 的威胁，艰难梭菌拥有一套强大的 ROS 解毒酶 “武器库”。其中，超氧化物还原酶（Sor）和红素氧还蛋白（Rbr）是两种关键的酶。

Sor 是一种 2Fe - SOR，它能够将 O₂^??还原为 H₂O₂。研究人员通过实验证实了 Sor 在体外具有超氧化物还原酶活性。在实验中，他们利用异源系统，发现大肠杆菌（Escherichia coli）的黄素二铁蛋白（Fdp）的截短铁氧还蛋白结构域（Rd - D）和相关还原酶能够在 NADH 存在的情况下还原 Sor。通过监测 Rd - D 的再氧化速率，研究人员计算出 Sor 的 O₂^??还原酶活性的表观速率常数（k_app）为 382 ± 8 min^?1。此外，Sor 还具有微弱的超氧化物歧化酶（SOD）活性，其 O₂^??歧化酶活性的k_app为 11 ± 1 min^?1。这些活性使得 Sor 在艰难梭菌应对 O₂^??的过程中发挥着重要作用。

Rbr 则属于一类在厌氧菌和梭菌中广泛存在的具有过氧化物酶活性的酶。它能够利用 NADH 作为电子供体，将 H₂O₂还原为水。研究人员通过实验测定了 Rbr 的 H₂O₂还原酶活性，其速率为 1.4 ± 0.3 s^?1，并且该酶还具有 O₂还原酶活性，速率为 0.8 ± 0.1 s^?1。这表明 Rbr 在艰难梭菌清除 H₂O₂和应对氧气暴露方面都有着重要的作用。

除了 Sor 和 Rbr，还有其他一些酶也参与了艰难梭菌的 ROS 解毒过程。例如，细菌铁蛋白共迁移蛋白（Bcp）是一种过氧化物酶，在 H₂O₂解毒中发挥着关键作用。研究人员通过构建突变体进行实验，发现缺失bcp基因的突变体在 H₂O₂暴露后的存活率显著降低，甚至比缺失rbr基因的突变体还要低。这说明 Bcp 在艰难梭菌抵抗 H₂O₂的过程中不可或缺。

另外，RevRbr2 和 FdpF 这两种 O₂还原酶也具有过氧化物酶活性，参与了 H₂O₂的抵抗。不过，它们在 H₂O₂解毒中的作用相对较小。

CD0828：神秘的 “辅助者”

在艰难梭菌的 ROS 解毒体系中，CD0828 是一个神秘的 “辅助者”。它是rbr操纵子的第四个基因，含有一个铁氧还蛋白（Rd）结构域。研究人员推测它可能作为 Rbr 和 Sor 的电子供体。

实验结果表明，CD0828 能够被 NADH 还原，但不能被 NADPH 还原。在有 FMN 存在的情况下，电子转移效率会提高。虽然 CD0828 能够将电子转移给 Rbr 和 Sor，但转移速率非常低，这表明它可能不是这两种酶在体内的有效电子供体。然而，在研究突变体的过程中发现，除了在perR_WT菌株中 4% O₂条件下，ΔCD0828突变体与 Δrbr突变体在 H₂O₂、4% O₂或空气暴露后的表型相似，这暗示着 CD0828 可能通过一种独立于 Rbr 或 Sor 活性的机制参与了 ROS 保护。

艰难梭菌的 “生存考验”：应对不同 ROS 环境

为了探究艰难梭菌在不同 ROS 环境下的生存能力，研究人员进行了一系列实验。

在 H₂O₂暴露实验中，研究人员构建了缺失rbr、sor、CD0828或bcp基因的突变体，并在不同的perR背景下进行测试。结果发现，所有突变体在 H₂O₂暴露后的存活率都显著下降，这表明这些基因在艰难梭菌抵抗 H₂O₂的过程中都发挥着重要作用。

当面对超氧阴离子（O₂^??）时，研究人员利用 menaione（一种能够产生大量 O₂^??的物质）进行实验。结果显示，Δsor突变体在含有 menaione 的培养基中生长受到显著抑制，这进一步证实了 Sor 在解毒 O₂^??中的特定作用。而 Δrbr突变体在这种条件下没有受到明显影响，这说明 Bcp、RevRbr2 和 FdpF 等酶似乎足以解毒由 O₂^??还原产生的 H₂O₂。

尽管艰难梭菌是严格厌氧菌，但它却能在高氧张力甚至空气中存活。研究人员发现，在空气暴露实验中，所有突变体的存活率都大幅下降，这表明 Rbr、Sor、CD0828 和 Bcp 在艰难梭菌应对空气暴露的过程中都起着重要作用。同时，实验还证实了空气暴露会导致艰难梭菌产生内源性 H₂O₂，而缺失 Rbr 和 Bcp 的突变体中 H₂O₂积累更为明显。

在模拟生理氧张力的实验中，研究人员发现，在 1% O₂条件下，艰难梭菌的存活率没有明显差异，也没有检测到 H₂O₂的产生。但在 4% O₂条件下，Δrbr、Δsor和 Δbcp突变体的存活率显著降低，并且 Δrbr突变体在 24 h 暴露后，培养基中的 H₂O₂浓度显著增加。这表明艰难梭菌在 O₂张力≥4% 时会产生内源性 H₂O₂，而 Rbr、Sor 和 Bcp 在保护艰难梭菌免受高氧张力的伤害中起着关键作用。

基因调控：艰难梭菌的 “智慧决策”

艰难梭菌对 ROS 解毒酶基因的调控十分复杂，涉及多个调控因子，这就像是它在面对不同 “战况” 时做出的 “智慧决策”。

perR基因编码的 PerR 是一种 H₂O₂感应阻遏蛋白，它能够调控rbr操纵子的表达。研究人员通过比较perR_WT和perR_mut菌株中相关基因的表达，发现 PerR 对rbr操纵子起到负调控作用。在perR_mut菌株中，由于 PerR 的突变，rbr操纵子的表达显著上调，使得菌株对 H₂O₂和空气的耐受性增强。

OseR 是一种新发现的 O₂响应调节因子，它参与了rbr操纵子和其他一些基因的调控。在厌氧条件下，OseR 会抑制rbr操纵子的表达；而在 H₂O₂或空气暴露时，OseR 的抑制作用会消失，导致相关基因的表达上调。研究人员通过构建 ΔoseR突变体进行实验，发现该突变体在 H₂O₂或空气暴露后，revrbr1、revrbr2和fdpF等基因的诱导表达消失，这表明 OseR 在这些基因的调控中起着重要作用。

σ^B是一种应激反应的 σ 因子，它在艰难梭菌的基因调控中也扮演着重要角色。对于bcp基因，其表达主要受 σ^B的控制。在应激暴露（如 H₂O₂或空气暴露）时，σ^B会促进bcp基因的表达，从而增强艰难梭菌对 ROS 的抵抗能力。而对于rbr操纵子，σ^B的调控作用较为复杂，它通过间接方式影响rbr操纵子的表达，可能是通过调控 OseR 的转录来实现的。

研究展望：为攻克艰难梭菌感染带来新希望

通过对艰难梭菌抗氧化应激机制的深入研究，人们对这种肠道致病菌的生存策略有了更清晰的认识。这些研究成果为开发新的治疗方法和预防策略提供了重要的理论基础。

在未来的研究中，进一步探究艰难梭菌 ROS 解毒酶的作用机制以及它们之间的相互协作关系，将有助于发现新的药物靶点。例如，针对 Rbr、Sor 等关键酶的抑制剂的开发，可能会为治疗艰难梭菌感染提供新的途径。同时，深入研究基因调控网络，了解如何精准地调控艰难梭菌的基因表达，也有望为预防和控制艰难梭菌感染提供新的思路。

此外，研究艰难梭菌在不同肠道微生态环境下的抗氧化应激反应，对于理解肠道菌群与病原菌之间的相互作用具有重要意义。这可能会为调节肠道菌群、增强宿主免疫力，从而预防艰难梭菌感染提供新的方法。

总之，对艰难梭菌抗氧化应激机制的研究是一场与病原菌的 “赛跑”，每一个新的发现都可能为攻克艰难梭菌感染带来新的希望，让人们在这场看不见的战争中逐渐占据上风。