乳酸脱氢酶（BbLDH）：莱姆病潜在治疗新靶点的深度探索

《mBio》：Lactate dehydrogenase is the Achilles’ heel of Lyme disease bacterium Borreliella burgdorferi

本文揭示了莱姆病菌（Borreliella burgdorferi）中乳酸脱氢酶（BbLDH）特性、作用及潜在抑制剂，为治疗莱姆病提供新思路。

　　### 莱姆病现状与治疗困境
莱姆病（Lyme disease，LD）是一种由Borreliella（曾用名Borrelia）burgdorferi引起的虫媒传染病。在欧美地区，它是最常被报道的蜱传疾病，且全球分布范围正不断扩大。仅在 2010 - 2018 年，美国每年就约有 476,000 例新发病例。

目前，莱姆病尚无有效的人类疫苗。基于外表面蛋白 A（OspA）的疫苗因安全问题已被撤回或停产，而基于 OspC 的犬用疫苗也无法用于人类。抗生素在莱姆病感染早期使用有一定疗效，但对于长期感染，其治疗效果不佳，约 10% - 20% 的患者会发展为治疗后莱姆病综合征（PTLDS），出现疲劳、认知障碍和肌肉骨骼疼痛等长期症状，且这些患者对抗生素治疗往往反应不佳。这可能是由于B. burgdorferi形成了耐药的 “持续” 细胞，在常规抗生素作用下，细菌会进入缓慢生长状态，类似蜱体内营养匮乏环境下的状态。因此，开发新型治疗方法迫在眉睫。

B. burgdorferi独特的代谢依赖

B. burgdorferi基因组由约 910 千碱基对的线性染色体和 20 多个环状及线性质粒组成。因其基因组较小，代谢系统简单，它高度依赖蜱媒介和哺乳动物宿主提供营养。例如，它缺乏脂质、核苷酸、氨基酸和辅因子合成相关基因，而是依靠 16 个广谱膜转运蛋白基因从细胞外环境摄取这些必需营养物质。

尤为特殊的是，B. burgdorferi不使用硫胺素（thiamin）。硫胺素通常在碳水化合物代谢和氨基酸生物合成中作为关键辅因子，被认为对所有生物都至关重要，但在B. burgdorferi基因组中却找不到其生物合成途径、转运蛋白或相关酶。此外，它还缺乏参与三羧酸循环（TCA cycle）的基因，如丙酮酸脱氢酶（PDH）基因。丙酮酸是细胞代谢的重要中间产物，不仅为细胞的合成代谢和分解代谢提供能量和辅因子，还能保护B. burgdorferi免受活性氧（ROS）的损伤。

为弥补这些不足，B. burgdorferi进化出了独特的代谢方式，依赖乳酸脱氢酶（lactate dehydrogenase，LDH）通过厌氧糖酵解实现持续的 ATP 合成和 NADH/NAD⁺的再生。其中，B. burgdorferi的 LDH（BbLDH）由bb_0087基因编码，在维持细胞内 NADH 和 NAD⁺平衡以及丙酮酸水平方面发挥着关键作用。然而，此前 BbLDH 的功能和结构尚未被深入研究，其在B. burgdorferi生存和感染中的重要性也未明确。

BbLDH 的特性研究

1. LDH 活性验证：BB_0087（即 BbLDH）由 316 个氨基酸残基组成，在所有已测序的Borrelia物种中高度保守，序列同一性约为 82%。研究人员通过亲和层析和尺寸排阻色谱（SEC）在天然条件下表达并纯化了全长 N 端带有 His 和 FLAG 标签的重组蛋白 rBB_0087。利用乳酸脱氢酶活性检测试剂盒，发现 rBB_0087 能够将乳酸转化为 NADH，且该活性可被非选择性 LDH 抑制剂棉酚（gossypol）完全抑制。此外，对 LDH 酶中三个保守残基（Thr146、Arg154 和 His178）进行定点突变，显著降低甚至消除了 BB_0087 的 NADH 依赖活性。这些结果表明，BB_0087 是一种真正的 LDH，具有与其他 LDH 相似的保守催化残基，且可被 LDH 抑制剂靶向。
2. 别构调节机制：与真核生物 LDH 不同，一些细菌 LDH 需要别构调节剂果糖 - 1,6 - 二磷酸（FBP）来达到最佳活性。序列比对发现，BbLDH 含有与Bacillus stearothermophilus LDH（BsLDH）中相似的保守残基 Arg156 和 His171，暗示其可能具有相似的调节机制。实验表明，添加 3 mM FBP 可使 BB_0087 对丙酮酸的K_m值从 6.2 mM（95% 置信区间：3 - 16 mM）降至 4.3 mM（95% 置信区间：2 - 12 mM），而将关键残基 His171 突变为 Ala 则完全消除了 FBP 对 BB_0087 的别构激活作用，证实了 BB_0087 受 FBP 别构调节。
3. 活性特征分析：进一步研究发现，BbLDH 可催化丙酮酸和乳酸的可逆转化。添加 3 mM FBP 能显著提高其对 NADH 的V_max值（从 41 μM/μg/min 提升至 60 μM/μg/min）和对 NAD⁺的V_max值（从 2.2 μM/μg/min 提升至 2.5 μM/μg/min）。BbLDH 的最佳工作 pH 范围为 5.0 - 7.0，最佳工作温度为 37°C。棉酚对 BbLDH 的抑制作用呈剂量依赖性，K_i值为 13 μM（95% 置信区间：11 - 14 μM）。
4. 结构解析：通过 X 射线晶体学技术，研究人员分别解析了 BbLDH 在结合和未结合 FBP 状态下的晶体结构，分辨率均达到 2.1 ?。BbLDH 形成同源四聚体（或二聚体的二聚体），每个单体包含八个 α - 螺旋和五个 β - 链，具有结合草氨酸盐（oxamate）、NADH 和 FBP 的位点。FBP 结合并未显著改变 BbLDH 四聚体的整体结构，其与 apo - 四聚体的均方根偏差（RMSD）仅为 0.230 ?。BbLDH 与二聚体的人类 LDH（HsLDH）和四聚体的 BsLDH 在结构上高度相似。在 BbLDH 四聚体中，四个 NADH/oxamate 结合位点和两个 FBP 结合位点高度相似，主要差异在于 NADH/oxamate 结合位点附近的 Gln85 - Arg91 环的相对位置。此外，溶液状态下的尺寸排阻色谱多角度光散射（SEC - MALS）分析表明，在 10 - 20 μM 浓度范围内，无论是否存在 NADH、oxamate、FBP 或它们的组合，BbLDH 在溶液中主要以二聚体形式存在。

BbLDH 在B. burgdorferi中的功能验证

1. 体外生长必需性：为研究 BbLDH 在B. burgdorferi生命周期中的作用，研究人员尝试构建bb_0087基因的完全敲除菌株，但多次尝试均未成功，推测该基因缺失对螺旋体可能是致命的。于是，他们构建了 IPTG 诱导的bb_0087条件敲除菌株（87^mut）。在体外 34°C 培养条件下，87^mut菌株在无 IPTG 时无法检测到 BbLDH 蛋白，且不能生长；添加 1 mM IPTG 后，BbLDH 蛋白表达恢复，菌株生长速率也恢复至野生型水平。这表明 BbLDH 对B. burgdorferi的体外生长至关重要，是开发小分子抑制剂的潜在靶点。
2. 体内感染性贡献：通过小鼠感染实验，研究人员进一步探究了 BbLDH 在B. burgdorferi致病过程中的意义。将野生型（WT）和 87^mut菌株分别接种到 BALB/c 小鼠体内，感染 3 周后处死小鼠。对耳组织进行定量逆转录聚合酶链反应（qRT - PCR）检测细菌载量，对血液样本进行血清转化分析。结果显示，87^mut感染的小鼠在饮用 IPTG 补充水后，耳组织中flaB转录本水平比未饮用的小鼠高五倍，且饮用 IPTG 补充水的小鼠血清转化率更高（4/4），而未饮用的小鼠仅 1/4 出现微弱的血清转化迹象。这表明 BbLDH 对B. burgdorferi在哺乳动物宿主中的感染性和适应性至关重要。

新型 LDH 抑制剂的筛选与分析

1. 抑制剂筛选：鉴于 BbLDH 在B. burgdorferi代谢和致病性中的重要性，它成为开发针对莱姆病的特异性代谢抑制剂的潜在靶点。研究人员首先对美国国家癌症研究所（NCI）的天然产物集 IV 库（NPS - IV，包含 419 种化合物）进行筛选。通过基于荧光的高通量筛选（HTS）实验，在第一轮筛选中，发现 23 种化合物在 10 μM 浓度下对 BbLDH 的活性有抑制作用。后续的二次筛选进一步确认了四种先导化合物，它们在微摩尔范围内对 BbLDH 活性具有抑制作用，且结构与棉酚不同。其中，化合物 45923 的抑制效果最为显著，K_i值为 54 μM（95% 置信区间：30 - 103 μM）。
2. 体外生长抑制作用：对这四种新发现的 LDH 抑制剂进行体外生长抑制实验，以棉酚和 DMSO 作为阳性和阴性对照。结果显示，棉酚在 100 μM 浓度下对B. burgdorferi生长有抑制作用。化合物 45923 在 100 μM 时抑制效果与棉酚相当，在 200 - 300 μM 浓度下，可抑制B. burgdorferi生长 99% - 100%。而其余三种化合物在 200 - 300 μM 浓度下，仅能抑制约 50% 的生长。综合来看，45923 是最具潜力的新型 LDH 抑制剂候选物。
3. 抑制剂结合模式分析：由于未能成功结晶 BbLDH 与棉酚或其他四种抑制剂的复合物，研究人员利用 Schrodinger 软件套件进行分子对接分析。Lineweaver - Burk 图显示，棉酚对丙酮酸底物表现为非竞争性抑制，而 45923、14975、114344 和 350085 为竞争性抑制。因此，将棉酚对接至含有 NADH 和 oxamate 的 BbLDH 模型，其他四种抑制剂对接至 apo LDH 模型。对接结果表明，棉酚与 BbLDH 的结合方式与它和 HsLDH 的结合方式相似，通过与 NADH 和乳酸 /oxamate 结合口袋相邻的环上的残基相互作用。其他四种抑制剂均定位于 NADH 和乳酸结合口袋，与一系列残基相互作用，如 Gly13、Gly14、Val15 等。其中，14975 和 114344 与 BbLDH 形成四个氢键，45923 形成一个氢键，350085 则不形成氢键或盐桥接触。
4. 对真核细胞的影响：在四种新发现的 LDH 抑制剂中，45923（补骨脂素，Methoxsalen）和 350085（ medicarpin）是市售化合物。通过对 HeLa 细胞（宫颈癌细胞系）和 TIGKs 细胞（永生化牙龈角质形成细胞系）进行生长抑制实验，以 DMSO 为阴性对照，棉酚为阳性对照。结果显示，棉酚在 1 - 2 μM 浓度下对 HeLa 和 TIGKs 细胞均有高度抑制作用。45923 在 10 μM 时开始对 HeLa 细胞表现出显著的生长抑制作用，但在 50 μM 时对 TIGKs 细胞仍无毒性。350085 在 5 μM 时开始抑制 HeLa 细胞生长，在 20 μM 时对 TIGKs 细胞表现出毒性，且其对 TIGKs 细胞的毒性浓度是对 HeLa 细胞的四倍。这表明癌细胞对这些 LDH 抑制剂比正常人类细胞更敏感，新型 LDH 抑制剂在 5 - 10 μM 浓度下可抑制 HeLa 细胞生长。

研究总结与展望

B. burgdorferi作为一种基因组容量有限的病原体，高度依赖宿主获取营养，其有限的代谢能力使糖酵解成为唯一的 ATP 产生途径。BbLDH 在糖代谢、维持细胞内丙酮酸水平以及保护螺旋体免受氧化损伤方面发挥着关键作用，是莱姆病治疗的有前景的靶点，其潜在应用还可扩展到其他由Borrelia物种引起的蜱传或虱传疾病。

本研究通过多种实验方法，深入揭示了 BbLDH 的生化和结构特征、在B. burgdorferi生存和致病中的重要作用，并发现了四种具有抗 LDH 活性的新型小分子化合物。这些发现为进一步研究靶向 BbLDH 治疗莱姆病的可行性奠定了坚实基础。未来的研究将聚焦于优化这些化合物的特异性和效力，利用 BbLDH 的晶体结构进行合理设计，开发更有效的针对B. burgdorferi的代谢抑制剂，有望为莱姆病的治疗带来新的突破。