mTOR 抑制剂雷帕霉素：对抗 LPS 诱导急性肾损伤及细胞衰老的新希望

《Scientific Reports》：mTOR Inhibition limits LPS induced acute kidney injury and ameliorates hallmarks of cellular senescence

为探究 mTOR 抑制剂雷帕霉素对 LPS 诱导急性肾损伤（AKI）的作用，研究发现其可减轻损伤，或助延缓慢性肾病进展。

　　在医学研究的广阔领域中，急性肾损伤（AKI）一直是个棘手的难题，尤其是败血症诱导的急性肾损伤（SI-AKI）。SI-AKI 不仅病情复杂，而且常常会引发慢性肾功能障碍，加速肾脏衰老，严重影响患者的健康和生活质量。目前，对于如何有效防治 SI-AKI，医学专家们仍在不断探索。

在这种背景下，来自意大利多所大学研究机构的研究人员开展了一项重要研究，相关成果发表在《Scientific Reports》上。他们聚焦于哺乳动物雷帕霉素靶蛋白（mTOR），试图探究 mTOR 抑制剂雷帕霉素对 SI-AKI 的作用及潜在机制。

为了深入研究，研究人员构建了小鼠模型，通过腹腔注射含有 10mg/kg 脂多糖（LPS）的溶液来诱导 AKI。实验设置了多个小组，其中两组内毒素血症小鼠分别在注射 LPS 前后接受雷帕霉素治疗。研究中用到了多种关键技术方法：对肾近端小管上皮细胞（RPTEC）进行全基因组 DNA 甲基化分析，以此来探究 LPS 对细胞表观遗传状态的影响；运用组织学分析，包括苏木精 - 伊红（H&E）染色和过碘酸 - 希夫（PAS）染色，来评估肾脏组织的损伤程度；采用免疫组化技术，检测相关蛋白如胶原蛋白 III、Klotho 和 CD39 的表达情况；还通过共聚焦激光扫描显微镜和流式细胞术，分析内皮细胞的表型变化 。

下面来看看具体的研究结果：

• mTOR 抑制可预防 LPS 诱导的 AKI：在成功诱导 AKI 的小鼠模型中，研究人员发现，LPS 注射 24 小时和 48 小时后，肾脏实质出现了明显的形态变化，比如肾小管空泡化、扩张、萎缩等，同时肾脏病理评分显著升高，血清肌酐水平也随时间增加。而雷帕霉素预处理在限制肾脏组织损伤方面比后处理更有效，两种处理方式都能显著减轻肾小管和肾小球的损伤，并抑制炎症细胞浸润。
• 雷帕霉素减少 LPS 诱导的 AKI 中的胶原沉积和肾纤维化：研究人员通过免疫组化分析发现，LPS 输注会导致肾脏间质和肾小球出现广泛的胶原沉积，且随着内毒素血症持续时间延长，肾纤维化程度加重。雷帕霉素预处理能显著减少两个部位的胶原 III 沉积，后处理也有一定效果，但不如预处理明显。
• mTOR 抑制可预防内毒素血症 AKI 中的内皮细胞功能障碍：利用双免疫荧光染色和流式细胞术分析，研究人员发现 LPS 输注会使内皮细胞（EC）发生表型变化，获得间充质标记物 α-SMA，而雷帕霉素预处理和后处理都能通过减少转化的 EC 来预防内皮功能障碍，使内皮细胞和功能失调的成纤维细胞标记物恢复到基础水平。
• ERK 通路在内皮功能障碍中的作用：通过分析相关信号通路关键蛋白的磷酸化水平，研究发现 LPS 暴露会使 EC 中磷酸化的 ERK、AKT、mTORC-1 和 p70S6K 表达显著增加。雷帕霉素预处理和后处理可降低 mTORC-1 和 p70S6K 的磷酸化水平，但不影响 AKT 和 ERK 的磷酸化。进一步研究表明，抑制 ERK 能显著降低 mTORC-1 和 p70S6K 的磷酸化水平，且抑制 ERK 的 EC 在 LPS 刺激后不会发生表型变化，这说明 TLR4-ERK-mTORC1 轴在促进 EndMT 和纤维化中发挥作用，且独立于 AKT 通路。
• LPS 诱导 RPTEC 中的 DNA 甲基化变化：对 RPTEC 进行全基因组 DNA 甲基化研究发现，LPS 刺激会增加整体基因组的 DNA 甲基化水平。通过差异甲基化分析，研究人员确定了 76 个异常甲基化区域，其中两个高甲基化基因 CD39 和 WFS1 是与能量产生和衰老相关的重要网络的中心节点。
• LPS 诱导的 DNA 甲基化调节 CD39 和 WFS1 基因表达：研究证实，LPS 刺激的 RPTEC 中，CD39 和 WFS1 基因的表达与 DNA 甲基化水平呈负相关，这表明这两个基因的表达直接受 DNA 甲基化调控，LPS 可诱导参与抗炎和抗纤维化途径的基因发生高甲基化。
• LPS 诱导 RPTEC 中的细胞衰老特征：研究人员通过 SA-β- 半乳糖苷酶（SA-β-gal）染色、评估 klotho 和 p21 表达以及检测 CD39 和 WFS1 标记物等实验发现，LPS 刺激 48 小时可使 RPTEC 获得衰老表型，而雷帕霉素处理能显著减轻 LPS 诱导的细胞衰老。
• 雷帕霉素治疗可防止体内 LPS 诱导的 CD39 下调：免疫组化和蛋白质印迹实验表明，LPS 输注会导致小鼠肾小管中 CD39 表达降低，雷帕霉素预处理可恢复其表达，后处理效果不明显。
• mTOR 抑制可防止体内 LPS 诱导的 klotho 下调：免疫组化和蛋白质印迹分析显示，LPS 输注会使小鼠肾小管中 klotho 表达显著降低，雷帕霉素预处理能有效恢复其表达，后处理也有一定效果，但不如预处理显著。

综合研究结果和讨论部分，该研究揭示了雷帕霉素在预防 SI-AKI 过程中，对内皮功能障碍和细胞衰老的抑制作用，以及对肾脏损伤的保护作用。研究发现 mTORC1-S6K 通路在 LPS 刺激下的激活机制，为理解 LPS 诱导的内皮功能障碍提供了新视角。此外，研究还确定了 CD39 和 WFS1 在肾脏衰老中的重要作用，为后续研究提供了新方向。不过，该研究也存在一定局限性，如 DNA 甲基化数据仅来自三批人 RPTEC，缺乏小鼠模型的相关数据，且 48 小时的 LPS 刺激可能无法完全反映其对 DNA 甲基化的动态影响。但总体而言，这项研究为预防和治疗 SI-AKI 提供了新的理论依据和潜在治疗策略，有望为改善患者预后带来新的希望 。