利用 HSV-TK 实现小鼠睾丸生殖细胞高效清除：开启生殖细胞移植研究新篇

《Scientific Reports》：Germ cell depletion using HSV-TK in mouse testes

为优化生殖细胞移植宿主制备方法，研究人员利用 HSV-TK/ganciclovir 系统，成功构建敲入小鼠，实现生殖细胞高效清除并产生后代，符合 “3R 原则”。

　　在生命科学的微观世界里，生殖细胞移植宛如一把神奇的钥匙，为众多领域开启了新的大门。它能助力研究男性生殖细胞的奥秘，推动转基因动物的培育进程，还能在珍稀物种的繁衍和生育力恢复等方面发挥关键作用。然而，这把钥匙想要顺利解锁这些领域，需要一个重要前提 —— 合适的生殖细胞 - free 宿主。但目前用于制备宿主的方法，就像一道道棘手的难题。比如使用抗癌药物白消安（busulfan）注射，它虽然能影响增殖的精原细胞，却像一个不分敌我的 “破坏者”，不仅会攻击其他分裂细胞，引发造血毒性，还会让实验动物承受痛苦；辐射法虽然能将损伤局限在阴囊区域，但需要特定的仪器设备，使用起来多有不便；而通过基因改造获得缺乏生殖细胞的动物，过程复杂且效率不高，像 c-Kit 突变小鼠（W/W^v trans heterozygote），通过杂合子小鼠繁殖获得预期基因型小鼠的概率仅为 25% ，Nanos2 敲除（KO）小鼠虽可用于猪、山羊和牛等动物的宿主，但在繁殖过程中会产生大量不必要的雄性个体。

为了突破这些困境，来自日本国立儿童健康与发展中心再生医学中心、川崎中央实验医学和生命科学研究所的研究人员 Constance Dollet、Miyuki Shindo 等人，开展了一项极具创新性的研究。他们巧妙地利用单纯疱疹病毒 1 型胸苷激酶（HSV-TK）/ 更昔洛韦（ganciclovir）系统，致力于开发一种更符合 “3R 原则”（替代、减少和优化）的生殖细胞清除新系统。这项研究成果发表在《Scientific Reports》上，为生殖细胞移植研究领域带来了新的曙光。

研究人员运用了多种关键技术方法。在构建实验动物模型方面，借助 CRISPR-Cas 系统获得了携带特定基因改变的小鼠。对于生殖细胞移植实验，将培养的精原干细胞（GS 细胞）移植到处理后的小鼠睾丸中，并通过检测绿色荧光蛋白（EGFP）荧光来评估移植效果。在后续的实验中，利用胞质内单精子注射（ICSI）技术，将移植后产生的精子注入卵母细胞，观察胚胎发育情况，进而判断精子的功能和生殖能力。

下面来看看具体的研究结果：

1. 敲入小鼠的产生：研究人员将 P2A 自切割肽和 HSV - 胸苷激酶（HSV-TK）基因插入到生殖细胞特异性基因 Vasa（也称为 Ddx4 或 Mvh）的 C 末端，构建了敲入小鼠。其中，使用了含有五点突变的 HSV-TK（HSV-TK30），以避免普通 HSV-TK 导致的雄性不育问题。结果显示，Vasa^wt/Tk30和 Vasa^Tk30/Tk30雌性小鼠以及 Vasa^wt/Tk30雄性小鼠均具有生育能力，而 Vasa^Tk30/Tk30雄性小鼠不育，其睾丸中细长精子细胞数量明显减少，精子头部似乎未能完全伸长。进一步实验表明，Vasa^Tk30/Tk30小鼠精子发生缺陷可能是由于 Mvh 基因的亚效突变。
2. 完全清除生殖细胞所需更昔洛韦的剂量：为确定有效清除生殖细胞的更昔洛韦剂量，研究人员给 3 周龄的 Vasa^wt/Tk30和 Vasa^wt/wt小鼠注射不同剂量的更昔洛韦。结果发现，2mg/kg 的更昔洛韦可使 Vasa^wt/Tk30小鼠睾丸明显变小变轻；5mg/kg 时，睾丸中精母细胞数量大幅减少；15mg/kg 时，几乎完全清除了生殖细胞。而高剂量（≥400mg/kg）的更昔洛韦对野生型小鼠睾丸也有不良影响，会导致睾丸重量下降、生殖细胞减少，还会影响小鼠体重。此外，对成年小鼠的研究表明，15mg/kg 和 150mg/kg 的更昔洛韦可有效清除 Vasa^wt/Tk30小鼠的生殖细胞，且这种清除效果在注射后 3 个月仍持续存在。
3. 生殖细胞丢失的时间进程：研究人员给成年 Vasa^wt/Tk30小鼠注射 15mg/kg 更昔洛韦后，在不同时间点收集睾丸进行分析。结果显示，注射后第 4 天，VIII 期小管中的细线期精母细胞大量减少；第 14 天，精母细胞几乎消失，大部分小管中出现圆形或细长精子细胞；第 25 天，约一半小管含有细长精子细胞，但其他生殖细胞类型消失。同时，通过免疫荧光分析发现，精原干细胞（SSCs）在注射后第 14 天几乎完全耗尽。
4. Vasa^wt/Tk30小鼠作为生殖细胞移植宿主小鼠：将培养的 GS 细胞移植到 Vasa^wt/Tk30小鼠睾丸中，4 个月和 9 个月后分别收获睾丸进行检测。结果发现，部分睾丸呈现 EGFP 信号，且观察到正常的精子发生过程。通过 ICSI 技术，利用移植后产生的精子成功获得了后代，表明移植的 GS 细胞能够在 Vasa^wt/Tk30小鼠睾丸中分化为精子并产生后代。

在研究结论和讨论部分，这项研究成功构建了用于生殖细胞移植的宿主小鼠，通过表达 HSV-TK30 并结合更昔洛韦注射，实现了高效的生殖细胞清除，且符合 “3R 原则”。与传统方法相比，该系统具有明显优势，如白消安处理后 3 个月睾丸有一定程度的精子发生恢复，且存在毒性风险，而本研究中的方法在注射 15mg/kg 更昔洛韦 3 个月后，几乎没有精子发生恢复的迹象，且无明显有害影响。此外，该研究构建的敲入小鼠还有潜在的应用价值，比如为胚胎干细胞（ES）细胞注射提供宿主胚胎，以及用于研究 Mvh 在精子发生后期的功能。综上所述，本研究开发的小鼠品系为生殖细胞移植研究提供了有力的工具，在生殖医学、转基因动物培育和濒危物种保护等领域具有广阔的应用前景，有望推动相关领域的进一步发展。