AAV载体空间基因组学揭示转录串扰机制，助力靶向递送大基因载荷

《Nature Biotechnology》：Spatial genomics of AAV vectors reveals mechanism of transcriptional crosstalk that enables targeted delivery of large genetic cargo

本研究聚焦于解决AAV载体包装容量有限导致的细胞类型特异性大基因载荷递送难题，通过空间基因组学技术揭示了AAV基因组间的转录串扰机制，并利用该机制实现了系统给药的细胞类型特异性基因编辑，为基因治疗提供了新策略。

　　

基因治疗领域一直面临着一个棘手的难题：如何将大基因载荷精准递送至特定细胞类型。AAV载体虽然具有诸多优势，但其包装容量有限，难以满足大基因载荷的递送需求。近期，加州理工学院的研究人员在《Nature Biotechnology》上发表了一项突破性成果，他们通过空间基因组学技术揭示了AAV基因组间的转录串扰机制，并巧妙地利用这一机制，实现了系统给药的细胞类型特异性基因编辑，为基因治疗领域带来了新的曙光。

基因治疗作为一种有望根治多种遗传性疾病的前沿技术，近年来取得了显著进展。然而，AAV载体的包装容量限制了其在递送大基因载荷方面的应用。例如，一些用于基因编辑的工具，如CRISPR–Cas9系统，其基因序列长度超出了AAV载体的包装范围。此外，为了实现细胞类型特异性表达，通常需要在AAV载体中加入增强子等调控元件，这进一步压缩了可用于基因载荷的空间。因此，如何突破AAV载体的包装限制，实现大基因载荷的精准递送，成为基因治疗领域亟待解决的问题。

加州理工学院的研究团队迎难而上，开展了这项具有开创性的研究。他们首先利用空间基因组学技术，对携带不同增强子的AAV基因组进行了深入分析，揭示了AAV基因组间的转录串扰现象。研究发现，当两个AAV基因组共感染细胞时，一个基因组中的增强子可以与另一个基因组中的启动子发生相互作用，从而驱动基因表达。这种转录串扰现象为解决AAV载体包装限制问题提供了新的思路。研究人员进一步开发了AAV-Zombie和SpECTr两种空间基因组学方法，能够在完整细胞和组织中单分子水平上定位AAV基因组及其串联形式，并证实了转录串扰依赖于AAV基因组的串联化。

基于转录串扰机制，研究人员成功实现了系统给药的细胞类型特异性基因编辑。他们以小鼠脑中的浦肯野细胞（Purkinje cells, PCs）为靶细胞，利用携带Ple155增强子的AAV基因组与携带Cas9基因的AAV基因组共感染，实现了仅在浦肯野细胞中特异性表达Cas9，并成功进行了基因编辑。这一成果不仅突破了AAV载体包装限制，还实现了基因编辑的细胞类型特异性，为基因治疗提供了新的策略和工具。

在研究过程中，研究人员采用了多种关键的技术方法。首先，他们利用空间基因组学技术，通过AAV-Zombie方法，将噬菌体RNA聚合酶启动子和条形码整合到AAV基因组中，实现了对AAV基因组的单分子定位。其次，他们开发了SpECTr方法，通过将条形码和T7 RNA聚合酶启动子分别整合到两个AAV基因组中，实现了对AAV基因组串联化的检测。此外，研究人员还利用CRISPR–Cas9基因编辑技术，通过转录串扰机制实现了细胞类型特异性的基因编辑。

研究结果表明，转录串扰现象具有广泛的适用性。研究人员测试了11种不同的增强子，发现它们都能与相应的启动子发生转录串扰。此外，他们还发现，转录串扰依赖于AAV基因组的串联化。在SCID小鼠模型中，由于缺乏DNA双链断裂修复酶Prkdc，AAV基因组的串联化减少，转录串扰现象也随之减弱。这一发现进一步证实了AAV基因组串联化在转录串扰中的关键作用。

研究人员还探索了转录串扰在基因治疗中的应用潜力。他们利用转录串扰机制，成功实现了系统给药的细胞类型特异性基因编辑。在小鼠模型中，研究人员通过共感染携带Ple155增强子的AAV基因组和携带Cas9基因的AAV基因组，实现了仅在浦肯野细胞中特异性表达Cas9，并成功进行了基因编辑。此外，他们还利用转录串扰机制，实现了对Cacna1a基因的细胞类型特异性敲除，并通过行为学实验和脑电图（EEG）记录，证实了该基因在浦肯野细胞中的功能缺失会导致小鼠出现共济失调和癫痫发作等表型。

本研究的结论具有重要意义。首先，研究人员揭示了AAV基因组间的转录串扰机制，为解决AAV载体包装限制问题提供了新的思路。其次，他们开发的AAV-Zombie和SpECTr两种空间基因组学方法，为研究AAV基因组的细胞内定位和串联化提供了有力工具。最后，研究人员利用转录串扰机制实现了系统给药的细胞类型特异性基因编辑，为基因治疗领域带来了新的希望。这一成果不仅有望突破AAV载体的包装限制，还为实现基因治疗的精准化和个性化提供了新的策略和工具。未来，研究人员将进一步探索转录串扰机制在其他细胞类型和疾病模型中的应用，为基因治疗的发展开辟新的道路。