CRISPR-Cas12a基因编辑小鼠模型助力疾病建模与免疫细胞工程

《Nature Biomedical Engineering》：Cas12a-knock-in mice for multiplexed genome editing, disease modelling and immune-cell engineering

本研究开发了Cas12a基因敲入小鼠模型，用于多重基因编辑、疾病建模和免疫细胞工程，为复杂基因相互作用研究提供了新工具，具有重要意义

　　

基因编辑技术的不断发展为生命科学和医学研究带来了新的机遇和挑战。近年来，CRISPR-Cas12a系统因其独特的多重基因编辑能力而受到广泛关注。

然而，将Cas12a应用于体内基因编辑和疾病建模仍面临诸多挑战。为了克服这些挑战，美国耶鲁大学的研究人员开发了一系列Cas12a基因敲入小鼠模型，这些模型具有条件性或组成性表达Cas12a的能力，为多重基因编辑、疾病建模和免疫细胞工程提供了强大的工具。这些小鼠模型不仅能够实现高效的基因编辑，还能够在多种细胞类型中进行应用，为复杂基因相互作用的研究提供了新的视角。研究结果表明，Cas12a基因敲入小鼠在体内基因编辑和疾病建模方面具有巨大的潜力，为未来的基因治疗和疾病研究奠定了坚实的基础。该研究发表在《Nature Biomedical Engineering》上，为基因编辑领域的发展注入了新的活力。

 在本研究中，研究人员主要采用了以下几种关键技术方法：首先，利用CRISPR/Cas9介导的基因编辑技术，通过显微注射将Cas12a基因敲入小鼠的Rosa26位点，构建了条件性或组成性表达Cas12a的小鼠模型。其次，研究人员开发了多种病毒和非病毒载体，如腺相关病毒（AAV）、脂质纳米颗粒（LNP）和逆转录病毒，用于将CRISPR RNA（crRNA）或向导RNA（sgRNA）递送至目标细胞或组织。此外，研究人员还利用流式细胞术、下一代测序（NGS）和免疫组化等技术对基因编辑效率和细胞表型进行了分析。 研究人员首先开发了条件性（LSL-LbCas12a和LSL-enAsCas12a）和组成性（LbCas12a和enAsCas12a）Cas12a基因敲入小鼠模型，这些小鼠模型具有C57BL/6背景。通过在不同器官中检测Cas12a蛋白的表达，研究人员发现Cas12a在脑、肝和肺中的表达水平较高。

此外，研究人员还对Cas12a基因敲入小鼠进行了全面的表型分析，包括血液学检查和组织病理学检查，结果表明这些小鼠在生理和病理方面与野生型小鼠没有显著差异。 为了验证Cas12a基因敲入小鼠在免疫细胞基因编辑中的应用，研究人员利用逆转录病毒介导的crRNA递送系统，在多种免疫细胞类型中实现了高效的基因编辑。例如，在LbCas12a小鼠的骨髓来源树突状细胞（BMDCs）、CD4+ T细胞、CD8+ T细胞和B细胞中，研究人员成功实现了单基因和多基因的敲除。通过流式细胞术和NGS分析，研究人员证实了基因编辑的效率和特异性。 研究人员还利用Cas12a基因敲入小鼠进行了体内基因编辑和疾病建模。例如，通过LNP递送crRNA至enAsCas12a小鼠的肝脏，研究人员成功实现了Ttr基因的敲除，并观察到血清中TTR蛋白水平的显著下降。此外，研究人员还利用AAV介导的crRNA递送系统，在enAsCas12a小鼠中同时敲除了多个肿瘤抑制基因（如Trp53、Apc、Pten和Rb1），成功诱导了唾液腺鳞状细胞癌（SCC）和肺腺癌（LUAD）的发生。通过对肿瘤组织的病理学分析和CODEX空间蛋白质组学分析，研究人员揭示了肿瘤组织的异质性和免疫细胞浸润情况。 此外，研究人员还开发了一种同时激活和敲除基因（DAKO）的系统，通过将Cas12a基因敲入小鼠与dCas9-SPH转基因小鼠进行杂交，实现了在单个细胞中同时进行基因激活和敲除。这一系统为研究基因之间的相互作用提供了新的工具。 

综上所述，本研究开发的Cas12a基因敲入小鼠模型为多重基因编辑、疾病建模和免疫细胞工程提供了强大的工具。这些模型不仅能够实现高效的基因编辑，还能够在多种细胞类型和组织中进行应用，为复杂基因相互作用的研究提供了新的视角。此外，研究人员开发的多种病毒和非病毒载体也为基因编辑的递送提供了多样化的选择。未来，这些Cas12a基因敲入小鼠模型有望在基因治疗和疾病研究中发挥重要作用。