成年小鼠脑室下区神经干细胞状态解析：标记物选择、异质性及代谢特征研究

《Stem Cell Reports》：Embracing the heterogeneity of neural stem cells in the subventricular zone

本文整合小鼠脑室下区（SVZ）单细胞 RNA 测序数据，揭示神经干细胞（NSC）标记物选择影响及细胞异质性，为相关研究提供重要参考。

　　### 成年小鼠脑室下区神经干细胞研究进展
在成年哺乳动物的大脑中，神经干细胞（NSCs）存在于特定区域，其中脑室下区（SVZ）的 NSCs 备受关注，它们是大脑修复的潜在细胞来源。然而，这些 NSCs 具有异质性，存在不同的激活状态，这使得对它们的研究充满挑战。

研究背景

NSCs 在大脑发育过程中，多数会进入静止状态（quiescent NSC，qNSC），随着年龄增长，这种静止状态更为明显。这种静止状态对于防止 NSC 耗竭和恶性肿瘤的发生至关重要，并且是可逆的，NSCs 会在激活增殖阶段和静止状态之间转换。

在这个转换过程中，NSCs 会经历中间激活状态，如从静止状态到所谓的 “准备静止状态”（primed-quiescent NSCs，pqNSCs），再到完全激活状态。这一过程伴随着新陈代谢、蛋白质翻译等方面的变化，以及细胞周期基因表达的增加。

为了研究 NSCs 的不同状态，科研人员使用了多种标记物来识别它们，常见的有 Gfap、Nestin 和 Sox2 等。不同的研究采用了不同的方法，比如使用报告基因小鼠系，或者结合荧光激活细胞分选（FACS）技术。但目前，缺乏对这些不同方法的比较，以确定哪种标记物对特定 NSC 状态更具选择性。

研究方法

研究人员整合了六个之前发表的成年小鼠 SVZ 的单细胞 RNA 测序数据集，这些数据集来自 39 到 90 天龄的小鼠，涵盖了不同的 NSC 标记物使用方法。

在数据处理方面，首先在 R Studio v.4.4.1 和 Seurat v.4.3.0 中进行质量检查和过滤。只保留在至少三个细胞中检测到的基因，以及表达至少 200 个基因的细胞；过滤掉基因数少于 200 个或多于 7500 个的细胞。然后使用 Seurat 的 NormalizeData 函数（LogNormalize 方法）进行归一化，通过构建广义线性模型对每个基因进行处理；再用 ScaleData 函数进行缩放，去除测序深度和文库制备对归一化表达值的影响。

数据整合使用 Seurat v.4.3.0，先确定每个数据集的 2000 个最可变基因，通过 FindIntegrationAnchors 函数找到数据集之间的锚点（dims 设为 30），再用 IntegratedData 函数创建包含所有数据的 Seurat 对象。

单细胞聚类和可视化则是基于整合后的数据，使用前 35 个主成分（PCs）进行聚类（RunPCA、FindNeighbors 和 FindClusters 函数，分辨率设为 0.4）。通过计算 UMAP 坐标（RunUMAP 函数，PC 设为 35）来可视化聚类结果，用 FeaturePlot 函数绘制基因表达值。确定标记基因时，要求基因在超过 60% 的细胞中表达，且调整后的 p 值小于 0.01（使用 Wilcoxon 秩和检验和 Bonferroni 校正）。此外，还利用 Seurat 的细胞周期回归评分管道对单细胞进行基于细胞周期评分的聚类，并通过选择感兴趣的簇进行子集化分析。

研究结果

1. 细胞群体和状态识别：通过无偏聚类分析和 UMAP 可视化，研究人员识别出多种细胞群体，包括少突胶质细胞、小胶质细胞、室管膜细胞，以及处于不同激活状态的 NSCs。在初始子集 1 中，包含了祖细胞、星形胶质细胞、神经母细胞和不同状态的 NSCs，其中 pqNSCs 数量最多，其次是活跃 NSCs（active NSCs，aNSCs）和 qNSCs。
2. 区分不同细胞类型：由于 qNSCs 和壁龛星形胶质细胞共享许多标记物，区分它们存在困难。通过细胞周期分析和多次子集化，研究人员成功区分了这两种细胞。例如，壁龛星形胶质细胞缺乏 Sox2 表达，且在特定基因表达上与 qNSCs 存在差异。
3. 细胞状态的动态变化：最终的子集 5 显示，NSC 状态具有高度动态性。除了 qNSCs 和 pqNSCs，还发现了处于过渡状态的 NSCs（tNSCs）。这些 tNSCs 有的从 pqNSC 向 qNSC 状态转变，有的从 pqNSC 向激活状态转变，反映了 NSC 在不同状态间转换的连续性。
4. 代谢途径分析：研究人员使用代谢基因面板分析不同 NSC 状态下的代谢途径。发现 qNSCs 和 pqNSCs 不仅表达参与脂肪酸氧化（FAO）和糖酵解的基因，还表达三羧酸循环（TCA）和氧化磷酸化的基因，这表明 qNSCs 并非处于低代谢状态，而是具有复杂的代谢表型。

研究讨论

1. 标记物选择的重要性：不同的 NSC 分离方法会导致获得的 NSC 状态比例不同。例如，Dulken 和 Kalamakis 的研究中 aNSCs 比例较高，而其他研究中 pqNSCs 比例较高。因此，在设计研究时，选择合适的标记物和分离方法至关重要，这会影响对 NSC 状态的研究结果。
2. 区域差异的影响：SVZ 不同区域的 NSC 具有不同的特性。如背侧 SVZ 和内侧、外侧壁的 NSC 在产生神经元类型和静止程度上存在差异。研究中不同数据集的细胞来源区域不同，这也会影响 NSC 状态的比例和特性。例如，Mizrak_Nestin 和 Xie 等人的数据集，由于细胞来自特定区域且使用 Nestin 标记，tNSCs 的比例较高。
3. 数据处理和分析的意义：去除数据中的 “噪声” 细胞，即高表达基因较多的细胞，可以提高分辨率，更好地识别不同的细胞状态和亚群。这有助于发现之前因低表达而未被检测到的基因，如 Gfap 在后续子集化过程中才被检测到。
4. 研究的局限性和展望：本研究主要针对年轻小鼠的 NSC 进行，未来研究可以探索在老年小鼠中是否有相似的结果，因为随着年龄增长，NSC 的基因表达和特性会发生变化。此外，研究中使用的标记物可能存在局限性，会引入偏差，影响新基因特征的识别，且无法考虑不同研究间细胞分离效率的差异。

总体而言，这项研究整合了多个数据集，深入分析了成年小鼠 SVZ 中 NSC 的不同状态，为选择合适的 NSC 标记物和研究方法提供了重要框架，有助于进一步理解 NSC 的异质性和动态变化，为大脑修复和神经再生研究奠定了基础。