突破基因工程！BITREx 开启串联基因阵列扩展新征程

《Cell Genomics》：Strategic targeting of Cas9 nickase expands tandem gene arrays

本文介绍了 BIR 介导的串联重复扩展（BITREx）技术，可用于扩展串联基因阵列，在多领域有应用潜力。

　　### 基因工程新突破：BITREx 技术助力串联基因阵列扩展
在生命科学的广袤领域中，基因的奥秘一直是科学家们探索的核心。基因复制作为生物进化和适应环境的关键驱动力，其中串联基因阵列的扩展尤为重要。它不仅能通过剂量效应促进生物适应环境变化，还能通过序列多样化形成基因家族，为生物的发展和演化奠定基础。例如，淀粉酶基因（AMY2B）在 domestic dogs 和 wolves 中的拷贝数差异，体现了基因剂量与生物适应环境的紧密联系；而人类 β - 珠蛋白基因座的多基因组成，则展示了基因家族在适应环境变化中的重要作用。然而，长期以来，实验诱导串联基因阵列的扩展一直是个难题。

为了解决这一挑战，科研人员经过深入研究，开发出了一种名为断裂诱导复制（Break - Induced Replication，BIR）介导的串联重复扩展（BITREx）的创新方法。

BITREx 技术的原理与设计

BITREx 技术巧妙地利用了 Cas9 切口酶（nCas9）和 BIR 机制。当 nCas9 被放置在串联基因阵列附近时，它会切断刚刚复制完阵列的复制叉，形成一个单端双链断裂（single - ended double - strand break，seDSB）。随后，seDSB 经过末端切除变成单链 DNA（single - stranded DNA，ssDNA）。由于断裂下游没有重复单元，ssDNA 常常会侵入上游的重复单元，从而启动异位 BIR，实现基因阵列的扩展。

BITREx 技术的实验验证与成果

科研人员首先以酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）为模型系统，对 BITREx 技术进行了验证。他们构建了一系列菌株，通过 β - 雌二醇诱导 nCas9 和 gRNA 的表达。实验结果令人振奋，当 nCas9 靶向到CUP1阵列的侧翼位点时，成功诱导了CUP1阵列的扩展。例如，在一些实验中，CUP1阵列的拷贝数显著增加，而且通过长期的 BITREx 实验，研究人员成功获得了兆碱基大小的CUP1阵列，其长度甚至超过了 1 Mb。

进一步研究发现，BITREx 技术还受到一些因素的影响。比如，组蛋白修饰相关的 Rtt109 蛋白对 BITREx 有重要作用。缺乏 Rtt109 时，BITREx 的效率会显著提高，能够更快速地扩展CUP1阵列，但同时也会导致阵列的稳定性下降。而烟酰胺（NAM）则可以抑制 BITREx，使扩展的CUP1阵列收缩，其作用机制与 Rtt109 / H3K56ac 通路密切相关。

此外，BITREx 技术的应用范围十分广泛。它不仅适用于非CUP1的自然串联基因阵列，如ENA1/2/5，还能应用于合成的串联基因阵列。研究人员通过实验证明，BITREx 可以成功扩展不同基因组位点的两单元阵列，无论是不间断的还是有间隔序列的阵列都能适用。而且，通过在重复单元中引入自主复制序列（ARS），可以进一步提高 BITREx 的效率。

创新之举：“splinted BITREx” 实现从头生成串联基因阵列

为了进一步拓展 BITREx 技术的应用，科研人员提出了 “splinted BITREx” 的概念。他们利用工程化的 DNA 作为 “夹板”，介导必要的模板转换，从而实现了从单拷贝序列从头生成串联基因阵列。在实验中，通过巧妙设计的菌株和质粒系统，成功观察到了串联基因阵列的形成，为基因工程的发展开辟了新的道路。

BITREx 技术在哺乳动物细胞中的探索

科研人员并未满足于在酵母中的研究成果，他们还将目光投向了哺乳动物细胞。通过构建特定的报告基因和设计相应的实验，研究人员在人类胚胎肾细胞（HEK293T）中成功验证了 BITREx 技术的可行性。例如，他们利用 nCas9 诱导 BIR，实现了 EGFP 基因的重组和荧光表达，证明了 BITREx 技术在哺乳动物细胞中同样能够发挥作用。此外，研究人员还将 BITREx 技术应用于人类基因组中自然存在的 D4Z4 阵列，发现可以增加其拷贝数，这对于研究相关疾病的治疗具有重要意义。

BITREx 技术的优势与应用前景

与其他类似技术相比，BITREx 技术具有独特的优势。它使用一个 gRNA，依赖 BIR 机制，能够应用于更广泛的靶点，甚至可以处理没有 ARS 的中断两单元阵列。这使得 BITREx 在基因工程领域展现出巨大的应用潜力。

在实际应用方面，BITREx 技术可以用于过表达感兴趣的基因。通过将其应用于含有生物合成基因簇的两单元阵列，可以提高生物合成途径产物的产量。此外，由于 BITREx 在每个细胞周期中随机发生，会导致细胞群体中途径成分的化学计量多样化，这有助于筛选出最优的途径设计，进一步提高产物产量。

同时，BITREx 技术还为研究宏卫星重复相关疾病提供了新的手段。例如，对于 D4Z4 阵列，其扩展可能对治疗面肩肱型肌营养不良症（FSHD）具有潜在意义。通过精准控制基因阵列的扩展，科研人员有望深入了解这些疾病的发病机制，并开发出更有效的治疗方法。

技术局限与未来展望

尽管 BITREx 技术取得了显著的成果，但它也存在一些局限性。该技术是复制偶联的过程，不适用于非分裂细胞，而且难以预测其在不同靶点的性能。此外，目前还没有有效的方法来稳定维持高度扩展的串联基因阵列。

然而，这些局限并不能阻挡科研人员前进的步伐。未来，研究人员将继续优化 BITREx 技术，深入研究其在不同细胞类型和基因组环境中的应用，探索更多提高其效率和稳定性的方法。相信在不久的将来，BITREx 技术将在基因工程、疾病治疗等领域取得更多突破，为生命科学的发展带来新的曙光。

BITREx 技术作为基因工程领域的一项重要突破，为串联基因阵列的扩展提供了强大的工具，在多个领域展现出了巨大的应用潜力。随着研究的不断深入，它有望为人类健康和生物科学的发展做出更大的贡献。