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本文通过研究 Vamp2rlss突变小鼠，揭示了突触功能与睡眠调控的紧密联系及相关机制。
研究背景
在睡眠 - 觉醒控制的神经生理和分子机制研究领域，尽管已取得一定进展，但大脑如何在全脑范围内调节睡眠和觉醒交替，以及突触释放等神经元功能的基本方面在其中是否发挥作用，仍有待明确。
研究人员通过正向遗传学睡眠筛选获得了不安定（rlss）小鼠品系，该品系的突触小泡蛋白 2（Vamp2）基因发生突变，编码关键突触释放机制蛋白 VAMP2。rlss 小鼠表现出一系列睡眠和行为表型，如在黑暗阶段非快速眼动睡眠（NREM sleep，NREMS）减少，快速眼动睡眠（REM sleep，REMS）时间总体下降，且睡眠和觉醒事件的数量以及状态转换显著减少，呈现出 “警觉状态惯性”。同时，Vamp2 突变导致 rlss 小鼠神经递质释放概率显著降低，改变了突触传递。这些现象引发了关于 rlss 小鼠表型特征对警觉状态电生理特征、睡眠质量以及清醒时睡眠压力积累的影响等问题。
脑电图（EEG）的慢波活动（Slow-wave activity，SWA），即 NREMS 中慢波频率范围（0.5 - 4Hz）的 EEG 功率，是评估睡眠 - 觉醒动态的常用指标。SWA 水平与睡眠 - 觉醒历史密切相关，常被用作睡眠压力的标记。此外，局部场电位（Local field potentials，LFPs）和多单元活动（Multi-unit activity，MUA）能在更局部的层面提供关于睡眠 - 觉醒动态的信息，有助于研究神经元沉默的潜在模式（“OFF 期”）。
在本研究中，研究人员利用 EEG、LFP 和 MUA 记录，结合睡眠剥夺（Sleep deprivation，SD）和听觉刺激范式，深入探究 rlss 小鼠的睡眠深度，旨在揭示其睡眠结构、警觉状态转换以及睡眠稳态的调控机制。
研究方法
- 实验动物：选用来自 rlss 品系（MGI:5792085，C3H.Pde6b + 背景）的小鼠，以及野生型（WT）同窝小鼠作为对照。所有实验操作均遵循英国动物 [科学程序] 法案 1986 年和牛津大学关于在科学研究中使用动物的政策，并符合动物研究：体内实验报告（ARRIVE）指南。
- 手术与植入：对小鼠进行 EEG 和层流探针植入手术。术前，小鼠注射地塞米松（0.2mg/kg，皮下注射）；手术过程中，在异氟烷麻醉（1 - 2%）下，将螺丝分别置于运动皮质区（额叶）、视觉皮质区（枕叶）、小脑和锚定点，同时在初级运动皮质进行小颅骨切开术，插入层流探针，并将其接地和参考至相应螺丝，最后用硅凝胶和牙科水泥固定。术后，给予小鼠地塞米松（0.2mg/kg，皮下注射）和美洛昔康（5mg/kg，皮下注射）进行恢复。
- 数据记录与处理：小鼠术后恢复至少 2 周后，转移至定制的透明有机玻璃笼中，置于通风、隔音的法拉第笼内，适应环境 3 天。记录前，小鼠需适应电缆至少 3 天。使用多通道神经生理学记录系统（TDT，美国）和 Synapse 软件记录信号，EEG 和 EMG 信号经滤波（0.1 - 100Hz）、放大后以 256.9Hz 的采样率存储。利用自定义的 Matlab 脚本提取和转换信号，使用 SleepSign 软件手动对警觉状态进行评分，通过快速傅里叶变换计算 EEG 功率密度谱。
- 实验范式
- 睡眠剥夺：在光照开始（ZT0）时对小鼠进行 6 小时的睡眠剥夺，通过提供新物体和拿走筑巢材料等方式保持小鼠清醒。睡眠剥夺结束后，让小鼠不受干扰地恢复至少 18 小时。
- 听觉刺激：在 24 小时内的 4 个时间段（ZT 0.5 - 2；ZT 7.5 - 9；ZT 12.5 - 14；ZT 20 - 21.5），向小鼠播放 8kHz、75dB 的声音，每次持续 8 秒，每分钟播放一次，共持续 1 小时 30 分钟（90 次重复）。
- OFF 期检测：使用由 C. Harding 开发的图形用户界面（GUI）检测低振幅神经活动段（“OFF 期”），选择稳定的 MUA 通道进行分析，根据特定参数计算并检测 OFF 期，部分实验仅关注 5% 最长的 OFF 期。
- 应用 “精细双过程模型”：按照 Guillaumin 等人的方法，对睡眠稳态相关模型参数（增益常数 gc、上升常数 rs 和上限渐近线 SU）进行估计和优化，使用 SWA 计算跨 24 小时基线日和睡眠剥夺日（6 小时睡眠剥夺 + 18 小时恢复睡眠）的数据。
研究结果
- rlss 小鼠警觉状态混合特征增加：通过 EEG 和 LFP 记录分析发现，rlss 小鼠在 NREMS 和 REMS 中极低频段的频谱功率较高，而在 REMS（仅 EEG）、NREMS 和清醒状态下高频段的功率较低。在 REMS 中，额叶 EEG 和 LFP 信号的频谱特征与 WT 小鼠存在差异，rlss 小鼠额叶 REMS EEG 中极低 δ 波段和 θ（及更高）频率增加，额叶 LFP 中 δ 波段上限增加。LFP 信号在 rlss 小鼠中振幅降低，尤其是在 NREMS 期间，呈现出类似全身麻醉、昏迷、体温过低和某些早期婴儿病理状态下的爆发抑制模式。这些结果表明，rlss 小鼠的睡眠惯性不仅表现为状态转换减少，还表现为所有警觉状态下类似默认模式特征的侵入，使得 NREMS、REMS 和清醒状态的典型频谱特征边界变得模糊。
- rlss 小鼠神经元沉默期延长：利用 MUA 记录和 “ON/OFF 期” 检测算法发现，rlss 小鼠在 NREMS 期间神经元放电会停止数秒，且以局部同步的方式发生，与 WT 小鼠相比，其同步神经元沉默期（OFF 期）显著延长，且与极低振幅、几乎等电位的 EEG 和 LFP 痕迹一致。在 REMS 和清醒状态下，rlss 小鼠的 OFF 期通常也更长。虽然并非所有通道都检测到长 OFF 期，但所有 rlss 小鼠至少有一个通道存在明显延长的 OFF 期，而 WT 小鼠则没有。此外，rlss 小鼠的 OFF 期持续时间存在更大的变异性，且在状态转换时，其警觉状态频谱特征的均匀性增加，细胞水平上的活动 - 沉默状态转换滞后于全局状态转换。
- rlss 小鼠睡眠稳态的改变：对 rlss 小鼠进行 6 小时睡眠剥夺后，其进入 NREMS 的潜伏期明显缩短，在睡眠剥夺后的 6 小时内，NREMS 时间增加 1 小时，REMS 时间减半。但在整个 18 小时的恢复期间，rlss 小鼠的睡眠结构恢复到基线水平，与 WT 小鼠相比，其 NREMS 和 REMS 时间仍较少。rlss 小鼠在睡眠剥夺后，SWA 的相对增加显著减少，这表明尽管其睡眠稳态在一定程度上得以保留，但 SWA 反映的睡眠压力积累速率可能与 WT 小鼠不同。通过数学模型分析发现，rlss 小鼠的睡眠压力消散速率较慢，其增益常数 gc 和 SU值显著降低，这使得它们在睡眠压力消散较慢的情况下仍能像 WT 小鼠一样快速达到基线睡眠水平。
- rlss 小鼠对听觉刺激的反应：在听觉刺激实验中，rlss 小鼠和 WT 小鼠的完全觉醒次数相似，但 rlss 小鼠的短暂觉醒次数显著减少，这可能反映了其之前描述的状态惯性。在 EEG 频谱分析中，rlss 小鼠和 WT 小鼠在 NREMS 和 REMS 期间对声音的反应存在显著差异，WT 小鼠对声音的 EEG 频谱变化更为明显。此外，研究还发现，除了在声音开始于 NREMS 时枕叶 EEG 中的 SWA 与声音期间的肌电图（EMG）水平有微弱相关性（仅在 WT 小鼠中显著）外，声音刺激的反应（即觉醒阈值）与预声音 SWA 水平之间没有明显关联。
研究讨论
- “睡眠开关” 的损伤：rlss 小鼠的研究结果支持 “警觉状态惯性” 的观点，即神经递质释放效率的降低导致其在连续警觉状态之间切换困难。先前研究提出了睡眠 / 觉醒开关的机制，而 rlss 小鼠中观察到的每个状态稳定性增加、警觉状态之间频谱特征相似等现象，表明如果存在睡眠开关，在这些小鼠中它不仅不能轻易地在状态之间转换，还可能处于 “泄漏” 状态，导致出现具有睡眠和清醒特征的混合状态。此外，与其他睡眠突变小鼠（如 Sleepy 小鼠）相比，尽管它们在睡眠表型上存在差异，但都表现出 NREMS δ 功率增加的现象，这进一步表明不同的遗传突变可能通过不同的机制影响睡眠，但最终在某些方面产生相似的睡眠特征变化。
- 更高的睡眠压力还是更易返回默认状态？：rlss 小鼠在基线条件下睡眠时间较短，这引发了关于它们是具有更高的睡眠效率、减少的清醒时睡眠压力积累，还是处于更高睡眠压力状态的疑问。通过对睡眠调节的双过程模型分析发现，rlss 小鼠的 S 上升速率相似，但下降速率和上限渐近线显著降低，这表明它们可能不是天生具有较高的睡眠压力，而是更倾向于进入或接近一种 “默认状态”。这一结论与先前关于皮质振荡在睡眠调节中作用的研究结果相呼应，即皮质振荡不仅是睡眠相关过程的基础，还在警觉状态控制中发挥作用，rlss 小鼠中持续的类似睡眠模式可能表明在睡眠和清醒状态下都存在部分睡眠债务的释放。
- 囊泡释放受损导致神经元 OFF 期延长：MUA 记录显示 rlss 小鼠在 NREMS 期间神经元活动呈现出独特的模式，慢波与延长的神经元沉默期相关，这在自然睡眠中很少见，更类似于 GABA 介导的全身麻醉状态。Vamp2 突变导致的囊泡释放受损可能是这种现象的原因，因为一般麻醉剂会通过与多个 SNARE 蛋白相互作用减少突触神经递质释放，而 rlss 小鼠的突变可能使它们呈现出一种 “固有麻醉” 的状态。此外，先前研究中注射 GABAA激动剂 muscimol 导致小鼠行为和 EEG 变化与 rlss 小鼠的发现相似，进一步支持了囊泡释放减少与增加抑制性张力相似的观点，即 rlss 小鼠的生理睡眠在多个方面更类似于非生理状态，如猝倒或麻醉状态，而不是正常睡眠。
- 在麻醉和清醒之间切换：研究表明，果蝇在状态之间切换需要神经元群体之间精确调节的兴奋和抑制平衡，而麻醉引起的意识丧失与睡眠和觉醒途径有关，睡眠稳态和麻醉的机制存在重叠。然而，传统观点认为睡眠和清醒是相互排斥的状态，而 rlss 小鼠的研究结果表明，这些状态可能处于一个连续体上，存在特征重叠。rlss 小鼠尽管大脑活动发生了深刻改变，但认知和行为表型仅轻度受损，这支持了警觉状态并非明确分离，而是可以共享特征的观点，这些特征可能会根据特定的清醒行为、化学操作或基因改变而波动。
研究结论
本研究通过体内实验和计算工作相结合的方式，为睡眠结构、警觉状态交替以及慢波产生的机制提供了新的见解。rlss 小鼠对外部刺激的反应能力表明，在出现可能导致进化劣势的表型之前，神经元动力学和睡眠 - 觉醒结构可以发生显著改变。研究结果支持全球突触功能和神经元兴奋性直接影响睡眠 - 觉醒结构的观点，同时也表明警觉状态和意识的分类方式可能需要重新审视，睡眠和清醒可能并非均匀的状态，而是处于从完全觉醒到深度昏迷（如深度麻醉）的连续体上。未来的研究可以进一步探究其他脑区在睡眠调控中的作用，以及不同遗传背景下睡眠机制的差异，这将有助于更深入地理解睡眠的奥秘及其在健康和疾病中的重要作用。
