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推荐语：本文综述癌症液体活检，介绍其生物标志物、检测方法、临床应用及未来前景。
# 癌症液体活检：现状、挑战与未来
引言
癌症严重威胁全球人类生命健康，2022 年有 2000 万人确诊癌症，数百万人因此丧生 。在众多国家，癌症是主要死因之一。早期检测癌症并制定个性化治疗方案，对提高患者生存率至关重要。目前，组织活检虽为肿瘤诊断的金标准，但存在样本采集困难、对患者有潜在伤害、无法连续监测病情变化等问题。
液体活检作为一种新兴技术，可通过分析体液样本中的循环肿瘤细胞（Circulating Tumor Cells，CTCs）、循环肿瘤 DNA（Circulating Tumor DNA，ctDNA）等生物标志物，实现肿瘤检测、特征分析及病情监测。其具有非侵入性、可重复采样等优点，能为肿瘤治疗决策提供重要信息，不过也面临检测灵敏度和特异性有限、缺乏标准化分析方法等挑战。
癌症液体活检生物标志物的主要分类
循环肿瘤细胞（CTCs）
CTCs 是从原发肿瘤或转移部位脱落进入外周血循环的肿瘤细胞。1869 年，人们首次在癌症患者血浆中发现 CTCs，但直到 2004 年，研究才证实其可作为晚期乳腺癌的独立预后指标 。此后，CTCs 成为研究热点。
循环肿瘤 DNA（ctDNA）
ctDNA 是肿瘤细胞通过凋亡或脱落释放到循环系统中的 DNA，是一种新兴的肿瘤生物标志物。1948 年，ctDNA 在血液中被首次发现 。随着研究深入，其在肿瘤检测、预后评估及治疗监测方面的作用逐渐被揭示。例如，2015 年的研究表明，ctDNA 检测可用于监测早期乳腺癌的微小残留病（Minimal Residual Disease，MRD），预测癌症复发概率 。
外泌体、细胞外囊泡（EVs）和微 RNA
外泌体是细胞分泌的一种细胞外囊泡，直径通常在几十到几百纳米之间 。早期，外泌体被视为细胞代谢废物，后来研究发现它在癌细胞间通信中发挥重要作用。外泌体中含有蛋白质、DNA 和各种 RNA，可作为液体活检的有效补充。微 RNA（microRNA）是外泌体中一类长度小于 700bp 的 RNA，研究发现其表达异常与肿瘤发生发展密切相关，可作为肿瘤诊断和预后评估的潜在标志物。
液体活检主要生物标志物的检测方法及相关技术挑战
循环肿瘤细胞检测方法及挑战
CTCs 在血液中含量极低（每毫升血液约 1 - 100 个细胞），且寿命短暂（1 - 2.5 小时），缺乏癌症特异性标记，这使得其检测面临诸多挑战 。为解决这些问题，科研人员开发了多种检测平台，检测过程通常包括富集、鉴定和检查。
免疫磁珠富集技术利用针对上皮细胞黏附分子（EpCAM）的抗体进行 CTCs 富集，如 CellSearch 系统，是目前广泛认可的 CTCs 检测方法，并获得美国食品药品监督管理局（FDA）批准用于结直肠癌（CRC）的 CTCs 检测 。但由于上皮 - 间质转化（EMT）过程中 EpCAM 表达下调，可能导致假阴性结果。
此外，还有基于物理特性（尺寸、灵活性、密度和电荷）的检测技术，如通过铁磁流体结合流式细胞术（FCM）检测 CTCs，以及大小筛选技术（ISET）等 。微流控技术在捕获稀有细胞方面展现出潜力，纳米技术的发展也有助于提高 CTCs 检测的精度和准确性。
循环肿瘤 DNA 检测方法及挑战
正常细胞和癌细胞都会释放游离 DNA（cfDNA）进入血液循环，ctDNA 是其中的特殊类型，在癌症患者体内通常占总 cfDNA 的 0.01 - 5% 。ctDNA 半衰期约为两小时，能快速反映肿瘤体积和治疗反应，是重要的肿瘤动态指标。
近年来，多种 ctDNA 检测技术不断涌现，主要包括基于聚合酶链反应（PCR）的方法和下一代测序（NGS）技术。基于 PCR 的方法，如数字聚合酶链反应（dPCR），具有成本低、速度快的优点，可检测预定义的癌症相关基因突变，但只能检测特定突变 。NGS 技术则能同时检测基因组序列，无需预先知道原发肿瘤信息，不过其成本较高，需要专业的生物信息学分析。
其他新兴液体活检标志物检测方法及挑战
对于外泌体等细胞外囊泡的分离，常用方法基于其物理和化学特性，如超速离心、过滤、捕获、微流控分离及基于聚合物的分离技术等。超速离心曾被认为是外泌体分离的最佳方法，利用外泌体与其他成分的密度和尺寸差异进行分离，操作简单、纯度高，但重复操作会降低外泌体纯度，且离心过程易损伤外泌体，不适合临床应用 。
过滤方法包括超滤、顺序过滤和尺寸排阻色谱（SEC）等，超滤常用于初步筛选样本粒径和减小样本体积，顺序过滤可依次去除细胞、细胞碎片和蛋白质，SEC 具有可重复、成本低且不损伤外泌体的优点 。捕获技术使用特异性结合外泌体表面蛋白的磁珠分离外泌体，选择性高，但成本高、产量低。微流控技术基于外泌体的物理和化学特性进行连续分离，效率高、成本效益好，但要求外泌体具有独特的免疫识别位点，系统本身也较为复杂。
微 RNA 检测最初面临短序列检测的难题，随着技术发展，已得到解决 。早期检测技术如 Northern 印迹和 RNA 保护试验，对 RNA 含量要求较高，如今捕获探针微阵列、磁珠平台及逆转录定量聚合酶链反应（RT - qPCR）等技术不断涌现，RT - qPCR 成为验证微 RNA 表达的金标准 。目前，微 RNA 检测面临的主要挑战是其在体液中的存在形式多样，包括游离形式和结合形式，不同来源的微 RNA 需要不同的分离策略，且易受其他因素干扰。
液体活检主要生物标志物的临床应用
循环肿瘤细胞的临床应用
在肺癌方面，非小细胞肺癌（NSCLC）是全球癌症相关死亡的主要原因之一 。对于 II - IIIA 期 NSCLC 患者，辅助治疗是标准治疗方案，CTCs 检测结果可影响辅助治疗决策。研究表明，及时检测和评估肿瘤可延长 NSCLC 患者术后总生存期（OS） 。此外，当获取组织活检样本困难时，CTCs 检测可用于识别 NSCLC 患者的间变性淋巴瘤激酶（ALK）基因重排，且能更好地反映肿瘤细胞多样性，有助于连续跟踪疾病进展 。
在结直肠癌（CRC）中，传统组织活检存在局限性，而 CTCs 监测可提供有关 MRD 长期存在的信息。研究发现，术后 2 - 3 年仍存在 CTCs 的 CRC 患者预后较差 。不过，CTCs 对早期 CRC 患者的诊断价值有限，不同检测方法的阳性率差异较大 。
在乳腺癌中，雌激素受体（ER）通路是 ER 阳性乳腺癌肿瘤生长的关键驱动因素。PAOLETTI 团队基于 CellSearch 系统开发了多参数 CTCs - 内分泌治疗指数（CTC - ETI），相关临床试验正在进行中 。此外，Her2 基因表达状态影响乳腺癌亚型和治疗，研究发现远处转移性乳腺癌和 CTCs 的 Her2 状态存在差异，相关机制及临床意义有待进一步研究 。
循环肿瘤 DNA 的临床应用
在肺癌领域，免疫治疗对 NSCLC 虽有显著疗效，但多数患者会出现早期疾病进展 。通过监测 ctDNA 变化可有效判断肺癌患者免疫治疗的疗效，有助于早期发现肿瘤生存状态和治疗效果，实现早期干预，防止疾病进展 。
对于乳腺癌，在新辅助治疗研究中，对 84 例高风险早期乳腺癌患者进行个性化 ctDNA 分析发现，ctDNA 过表达患者比例随治疗进展逐渐降低，且病理完全缓解（pCR）患者的 ctDNA 结果均为阴性 。这表明 ctDNA 检测对预测乳腺癌患者复发风险具有较高价值，可作为评估治疗效果和预后的关键指标 。
在结直肠癌（CRC）方面，术后监测复发和选择辅助治疗对患者至关重要 。研究显示，ctDNA 检测可有效监测 CRC 患者术后复发，比传统影像学检查提前 16.5 个月发现复发 。此外，ctDNA 检测还可用于评估 II 期和 III 期 CRC 患者的复发风险，指导辅助治疗决策 。
其他新兴液体活检标志物的临床应用
外泌体在癌症诊断和治疗中具有重要作用 。在诊断方面，外泌体由活细胞持续释放，能提供有关非死亡肿瘤细胞的信息，增加早期病变检测的机会 。而且，外泌体独特的组成使其适合进行联合分析，多项研究表明联合分析比单一生物标志物分析更具优势 。
在治疗方面，外泌体可作为癌症治疗药物的载体，与传统药物载体相比，具有更高的生物利用度和更低的细胞毒性 。研究证实，以巨噬细胞来源的外泌体作为药物载体，可显著提高小鼠肺癌肿瘤对药物的摄取，且药物封装在外泌体中对耐药细胞的细胞毒性比游离药物高 50 倍，在动物实验中还能有效抑制肿瘤生长，减少副作用 。
微 RNA 在癌症液体活检中也展现出重要价值 。例如，miR - 210 是早期乳腺癌的独立预后因素，miR - 21 的上调与癌症临床分期、淋巴结转移及患者生存率相关 。此外，微 RNA 表达变化在多种实体瘤中都有发现，如前列腺癌、肺癌等 。通过联合微 RNA 分析和表面增强拉曼散射（SERS）检测尿液样本，可辅助膀胱癌的诊断，且比单一分析方法预测效果更好 。
基于 CTCs 和 ctDNA 联合检测的液体活检在癌症中的应用
CTC 和 ctDNA 联合检测对肿瘤预后评估和动态监测的临床意义
CTCs 在肿瘤形成早期即可进入血液，参与肿瘤细胞的远处转移，而 ctDNA 携带肿瘤特异性信息，主要来源于肿瘤细胞的坏死或程序性死亡 。CTCs 可在单细胞水平可视化监测 MRD，ctDNA 检测则从分子生物学角度反映 MRD 的存在 。
通过联合检测 CTCs 和 ctDNA，能更全面、动态地了解肿瘤情况，有效监测 MRD 。研究表明，联合检测可提前 6 - 9 个月发现肿瘤复发，比传统临床指标或影像学检测更灵敏 。例如，在肝癌研究中，联合检测 CTCs 和 ctDNA 能更准确地识别术后 MRD，预测复发，且特异性高达 81.6% 。
CTCs 和 ctDNA 联合应用在突变检测中的临床可行性
许多研究证实，CTCs 和 ctDNA 评估可提供互补的遗传信息 。例如，对乳腺癌患者的研究发现，在检测 ESR1 突变时，CTCs 和 ctDNA 的结果存在差异 。在检测 PIK3CA 突变时，早期和晚期乳腺癌患者的 CTCs 和血浆 ctDNA 中均频繁出现热点突变，且突变状态在治疗后会发生变化 。
在非小细胞肺癌（NSCLC）患者中，使用晶体 dPCR 检测 EGFR 突变，发现 CTCs 和 ctDNA 的评估结果互补 。这些研究表明，联合检测 CTCs 和 ctDNA 可减少 “误诊”，提高肿瘤突变检测的准确性，为肿瘤治疗提供更精准的信息 。
机器学习在液体活检数据分析中的应用
诊断
液体活检通过检测基因突变评估癌症存在，但单一预测指标存在局限性 。机器学习模型可对检测到的突变进行分类和分析，确定具有临床价值的突变 。例如，F. Mouliere 等人利用逻辑回归和弹性网络等模型分析肺癌患者血浆样本中 ctDNA 的存在概率 。此外，通过分析 cfDNA 的全基因组甲基化序列，可确定 ctDNA 的组织来源，且短序列 ctDNA 也能显著提高机器学习模型的诊断能力 。
预后
在癌症预后方面，机器学习的重要作用之一是确定转移性肿瘤的原发器官，这对评估肿瘤预后至关重要 。研究人员开发了随机森林模型，通过分析基因表达特征预测肿瘤起源 。虽然目前这些应用多基于传统活检样本，但随着液体活检测序数据的不断积累，机器学习在该领域将有更广阔的发展前景 。
治疗和监测
临床癌症治疗决策依赖于治疗指南和临床试验结果，但传统临床试验样本量较小，难以确定所选治疗方案对大多数患者的有效性 。机器学习可整合和分析大量癌症患者的测序数据和复杂临床信息，为治疗决策提供参考 。
例如，连续个体化风险指数（CIRI）可模拟癌症患者接受不同治疗时 ctDNA 的动态变化，评估治疗反应 。在液体活检中，结合单细胞转录组学分析 CTCs，再利用机器学习模型预测药物敏感性和耐药可能性，有助于实现个性化治疗，提高患者生存率和生活质量 。
未来展望与结论
近年来，液体活检为癌症诊断和治疗带来新策略，推动了肿瘤个性化治疗的发展 。然而，液体活检仍面临诸多挑战 。
在技术层面，虽然 CTCs 和 ctDNA 检测技术不断发展，但检测准确性仍受多种因素影响，如生物标志物浓度、检测技术的标准化等 。目前，美国的 BloodPac 和欧洲的 CancerID 等机构致力于建立标准化检测方案，但 CTCs 和 ctDNA 的形成机制尚不完全清楚，这也限制了检测技术的进一步优化 。
在临床研究方面，现有临床研究存在样本量小、缺乏对照组、仅评估常见突变基因等问题 。因此，需要开展更大规模、长期、多中心的研究，进一步验证液体活检的临床有效性和可靠性 。
此外，其他血液成分如外泌体和肿瘤教育血小板（TEPs）也具有作为液体活检生物标志物的潜力 。外泌体在肿瘤发生发展过程中发挥多种作用，但在临床应用中面临靶向效率低、易被免疫清除及分离纯化困难等问题 。TEPs 具有血液中含量丰富、易于分离、RNA 质量高及对外界信号敏感等优点，与其他生物标志物联合应用，有望为早期肿瘤诊断和非侵入性疾病监测提供新途径 。
总体而言，虽然液体活检目前无法完全取代肿瘤活检，但在癌症早期诊断、术后监测、治疗反应评估及耐药性检测等方面具有重要价值，是个性化医学的重要组成部分，有望在未来成为临床常规实践。
