《BMC Genomics》：Identification and characterization of the TmSnRK2 family proteins related to chicoric acid biosynthesis in Taraxacum mongolicum
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为探究蒙古蒲公英菊苣酸生物合成机制，研究人员对 TmSnRK2 家族展开研究，揭示其关键作用，意义重大。
蒙古蒲公英是一种在全球广泛分布且应用价值极高的植物，它富含酚酸等多种成分，在食品和医药领域都有着重要用途。像大家熟知的蒲地蓝消炎口服液，其主要原料就是蒙古蒲公英，在对抗病毒感染方面发挥着重要作用。然而，蒙古蒲公英中菊苣酸（一种重要的药用指标成分）的生物合成机制却一直是个谜，这就像一座神秘的宝藏等待人们去挖掘。为了揭开这个谜团，来自江苏省中国科学院植物研究所、浙江中医药大学等机构的研究人员踏上了探索之旅。他们的研究成果发表在《BMC Genomics》上，为我们深入了解蒙古蒲公英中菊苣酸的合成机制提供了关键线索。
研究人员运用了多种技术方法来开展这项研究。首先是液相色谱 - 质谱（LC - MS）技术，通过它来测定菊苣酸及其相关化合物在不同组织中的含量；转录组测序技术也至关重要，研究人员对蒙古蒲公英不同组织进行转录组测序，获得了大量的基因数据，为后续分析基因表达差异和相关通路奠定了基础；此外，还有酵母双杂交（Y2H）、双分子荧光互补（BiFC）以及双荧光素酶报告实验等，这些技术帮助研究人员探究蛋白之间的相互作用以及对基因表达的影响。
在研究结果方面，研究人员首先对蒙古蒲公英不同组织中的菊苣酸及其前体化合物进行了测定。通过 LC - MS 代谢物分析，他们发现了 11 种菊苣酸相关化合物。结果显示，菊苣酸及相关化合物在叶子中的含量比在花和根中更高。例如，5 - O - 咖啡酰奎宁酸、绿原酸和异绿原酸 A 在花中含量最高，奎宁酸在根中含量最高，而酒石酸、L - 苯丙氨酸等在叶子中含量最高，且部分化合物在某些组织中未被检测到。这表明叶子是积累菊苣酸及其相关化合物的重要部位，为后续研究提供了方向。
接着，研究人员进行了转录组测序和基因注释。他们选取了蒙古蒲公英的叶、根和花三个不同组织构建 9 个 cDNA 文库，利用 Illumina 成对末端测序技术进行测序，获得了 65.09Gb 的干净数据和 77,035 个单基因。通过对这些数据的分析，他们对单基因进行了功能分类和注释，发现许多基因参与了各种生物过程、分子功能和细胞组成相关的通路，这为理解蒙古蒲公英的生物学特性提供了丰富的信息。
随后，研究人员对单基因进行了差异表达分析。通过主成分分析（PCA）发现叶、花和根样本具有良好的重复性和显著差异。进一步分析发现，共有 22,994 个单基因在所有三个组织中表达，还有一些基因在特定组织中特异性表达。在比较叶与根、叶与花的基因表达水平时，研究人员鉴定出了 30,302 个差异表达基因（DEGs），这些差异表达基因涉及光合作用、植物激素信号转导和苯丙烷生物合成等过程，与菊苣酸生物合成密切相关。
在对菊苣酸生物合成基因和相关转录因子（TFs）的分析中，研究人员发现了 31 个菊苣酸生物合成差异表达基因，其中 Tm4CL1 与菊苣酸生物合成最为相关。同时，他们还分析了不同组织中的转录因子，发现了 20 个家族共 1271 个成员，其中 MYB、AP2/ERF 和 bHLH 是最大的三个转录因子家族。进一步研究发现，Tm4CL1 属于一个特定的基因集，在这个基因集中，DN6654_c0_g2（TmbZIP1）与菊苣酸生物合成相关，还有 37 个转录因子可能对菊苣酸生物合成起到调节作用。
研究人员还对蒙古蒲公英中的 TmSnRK2s 进行了深入分析。他们在蒙古蒲公英基因组中鉴定出 7 个 SnRK2 成员，并对其进行了系统发育关系、基因结构和保守基序组成等方面的分析。结果表明，所有成员都含有 9 个内含子，根据系统发育比较，TmSnRK2s 可分为三组。同时，分析其启动子顺式元件发现，这些元件与 ABA、MeJA 和 SA 激素信号以及光信号转导密切相关，这意味着 TmSnRK2s 广泛参与各种信号通路。
在对 TmSnRK2 表达水平和亚细胞定位的研究中，研究人员通过筛选内部参考基因，利用 qRT - PCR 技术检测了 TmSnRK2 在不同组织和 ABA 处理下的表达水平。结果发现，不同的 TmSnRK2 在不同组织中的表达存在差异，且大部分 TmSnRK2 对 ABA 激素有显著响应。亚细胞定位实验表明，TmSnRK2.2、TmSnRK2.3、TmSnRK2.4、TmSnRK2.6 和 TmSnRK2.7 定位在细胞质和细胞核中，而 TmSnRK2.1 和 TmSnRK2.5 仅定位在细胞质中。
通过 Y2H 和 BiFC 实验，研究人员探究了 TmSnRK2s 与 TmbZIP1 之间的相互作用。结果显示，TmSnRK2.1、TmSnRK2.3、TmSnRK2.6 和 TmSnRK2.7 能够与 TmbZIP1 形成异二聚体。进一步研究发现，‘Q (S/G)(V/D)(D/E)(I/L)××I (I/V)×EA’和‘D×(D/ED××D)’是 TmSnRK2s 与 TmbZIP1 结合的核心位点，并且 TmSnRK2.3 的蛋白激酶激活域也能与 TmbZIP1 相互作用。
最后，研究人员通过双荧光素酶报告实验评估了 TmSnRK2s 对 TmbZIP1 - Tm4CL1 启动子稳定性的影响。结果表明，TmSnRK2.3 和 TmSnRK2.6 显著增加了 TmbZIP1 - Tm4CL1 的表达，而 TmSnRK2.4 则抑制了这种表达，这说明 TmSnRK2s 可以直接或间接地影响 TmbZIP1 - Tm4CL1 相互作用的稳定性。
在研究结论和讨论部分，研究人员通过 LC - MS 和转录组分析，揭示了 TmbZIP1 - Tm4CL1 通路在菊苣酸生物合成转录调控中的关键作用。同时，他们对 TmSnRK2 家族进行了全面的鉴定和表征，发现不同的 TmSnRK2 在组织表达、亚细胞定位以及与 TmbZIP1 的相互作用等方面存在差异，这些差异可能影响菊苣酸的生物合成。此外，研究还发现不同物种中 SnRK2 成员数量存在差异，这可能与基因复制、缺失和多倍体化有关，而蒙古蒲公英中 TmSnRK2 基因可能在进化中获得了新的功能。
总的来说，这项研究深入揭示了蒙古蒲公英中与菊苣酸生物合成相关的 TmSnRK2 家族蛋白的特性和作用机制，为进一步研究菊苣酸的生物合成提供了重要依据，也为蒙古蒲公英在食品和医药领域的开发利用奠定了理论基础。
