双色免疫组化技术揭示人脑组织线粒体呼吸链缺陷的新方法

《Acta Neuropathologica Communications》：Chromogen-based double immunohistochemical detection of mitochondrial respiratory chain deficiencies in human brain tissue

本研究针对传统线粒体呼吸链（MRC）检测方法的局限性，开发出一种双色免疫组化技术，可同时检测MRC复合体和线粒体质量，为神经退行性疾病研究提供新工具，具有重要的临床和科研意义。

　　

线粒体呼吸链（MRC）功能异常与多种神经退行性疾病密切相关，如帕金森病（PD）、阿尔茨海默病（AD）和肌萎缩侧索硬化（ALS）。传统的免疫组化方法在检测MRC复合体时存在诸多限制，例如只能检测单一抗原，无法同时评估MRC复合体和线粒体质量，且在处理死后脑组织样本时存在组织形态学保留不佳等问题。为解决这些问题，国外研究团队开发了一种双色免疫组化技术，通过结合3,3’-二氨基联苯胺（DAB）和品红染色，实现了在同一脑组织切片上同时检测MRC复合体和线粒体标记物电压依赖性阴离子通道1（VDAC1）。该技术不仅提高了检测的准确性，还显著减少了分析所需组织量，这对于稀缺的人类脑组织样本尤为重要。研究以POLG基因突变导致的神经疾病患者脑组织为模型，验证了该方法的可靠性和有效性，为神经退行性疾病的病理机制研究和诊断提供了新的有力工具。该成果发表在《Acta Neuropathologica Communications》上。

线粒体作为细胞的能量工厂，其功能的正常与否对细胞的生存和功能至关重要。线粒体呼吸链（MRC）是细胞能量代谢的核心过程，负责产生细胞所需的大部分三磷酸腺苷（ATP）。然而，MRC功能异常与多种疾病的发生发展密切相关，包括线粒体疾病、神经退行性疾病以及衰老过程。在神经退行性疾病中，如帕金森病（PD）、阿尔茨海默病（AD）和肌萎缩侧索硬化（ALS），MRC功能障碍被认为是疾病发生和进展的关键因素之一。因此，开发一种能够准确检测MRC复合体缺陷的方法对于理解这些疾病的病理机制和寻找潜在的治疗靶点具有重要意义。

传统的MRC检测方法，如免疫组化（IHC）和免疫印迹，虽然能够提供一定的信息，但在实际应用中存在诸多局限性。例如，传统的免疫组化方法只能检测单一抗原，无法在同一组织切片上同时评估MRC复合体和线粒体质量。此外，免疫荧光虽然能够实现多靶点染色，但在处理死后脑组织样本时，组织形态学保留不佳，且存在较高的个体间差异。这些局限性使得研究人员难以准确评估MRC复合体在疾病中的变化情况。

为了解决这些问题，国外研究团队开发了一种创新的双色免疫组化技术。该技术通过结合DAB和品红染色，实现了在同一脑组织切片上同时检测MRC复合体和线粒体标记物VDAC1。研究团队选择了POLG基因突变导致的神经疾病患者脑组织作为模型，因为这种疾病模型具有典型的MRC复合体缺陷特征，即复合体I和IV缺陷，而复合体II正常。通过这种双色免疫组化技术，研究人员能够在单细胞水平上准确识别MRC复合体缺陷的神经元，并且显著减少了分析所需组织量，这对于稀缺的人类脑组织样本尤为重要。

在研究中，研究人员首先从患有POLG基因突变的神经疾病患者和健康对照组中获取了额叶皮层、枕叶皮层、海马和小脑的脑组织样本。然后，他们使用针对MRC复合体I（NDUFS4抗体）、复合体II（SDHA抗体）和复合体IV（MTCOI抗体）的特异性抗体，结合DAB染色，对组织切片进行免疫组化染色。随后，使用针对线粒体标记物VDAC1的抗体，结合品红染色，对同一组织切片进行二次染色。通过这种双色染色方法，研究人员能够在同一细胞内同时观察到MRC复合体和线粒体质量的变化情况。

研究结果显示，与健康对照组相比，POLG基因突变患者的脑组织中，复合体I和IV的阳性神经元比例显著降低，而复合体II的阳性神经元比例则没有明显差异。这种差异在小脑的浦肯野细胞和海马的CA4区域表现最为明显。例如，在小脑浦肯野细胞中，POLG基因突变患者的复合体I阳性神经元比例仅为33.90% ± 11.85，而健康对照组为77.60% ± 17.23。在海马CA4区域，POLG基因突变患者的复合体I阳性神经元比例为54.14% ± 3.46，而健康对照组为97.03% ± 1.61。这些结果表明，POLG基因突变导致的MRC复合体I和IV缺陷在特定脑区的神经元中表现尤为显著，而复合体II则未受影响。此外，研究人员还发现，这种双色免疫组化技术具有较高的可重复性和可靠性，不同观察者之间的评估结果具有高度一致性（ICC系数=0.91，95%置信区间[0.851–0.942]，p<0.001）。

该研究开发的双色免疫组化技术具有多项优势。首先，它能够在同一细胞内同时评估MRC复合体和线粒体质量，确保观察到的染色强度差异是由于MRC复合体水平的变化，而不是由于细胞内线粒体数量的差异。其次，该技术保留了组织的形态学结构，这对于后续的组织学分析和病理诊断具有重要意义。此外，该技术还减少了分析所需组织量，这对于稀缺的人类脑组织样本尤为重要。最后，与以往的双色免疫组化方法相比，DAB和品红染色组合具有更好的颜色对比度和稳定性，避免了其他染色方法中存在的颜色交叉反应和溶解问题。

总之，这项研究开发的双色免疫组化技术为检测人脑组织中的MRC复合体缺陷提供了一种可靠、有效的工具。该技术不仅提高了检测的准确性，还减少了分析所需组织量，对于神经退行性疾病的病理机制研究和诊断具有重要的临床和科研价值。未来，该技术有望在其他神经退行性疾病的研究中得到广泛应用，为揭示这些疾病的发病机制和寻找潜在的治疗靶点提供新的思路和方法。