甘蓝型油菜 CHYR 基因家族的全基因组分析及 BnA03.CHYR.1 在盐胁迫下的功能验证

《BMC Plant Biology》：Genome-wide analysis of CHYR gene family and BnA03.CHYR.1 functional verification under salt stress in Brassica napus L.

为探究甘蓝型油菜 CHYR 基因家族在应对非生物胁迫中的作用，研究人员进行全基因组分析，发现 BnA03.CHYR.1 可增强拟南芥盐胁迫耐受性，为研究植物抗逆机制提供依据。

　　在植物的生长过程中，它们就像 “不动的战士”，要不断应对各种外界挑战，比如干旱、高盐、低温等非生物胁迫。甘蓝型油菜（Brassica napus）作为重要的油料、蔬菜和饲料作物，也深受这些不利环境的影响。CHYR（CHY 锌指和 RING 指）蛋白属于 RING 型 E3 泛素连接酶家族，在植物生长、发育和应对各种胁迫中发挥着重要作用 。然而，尽管在许多物种中对 CHYR 家族已有研究，但在甘蓝型油菜中，其全基因组层面的特征和功能却鲜为人知。为了填补这一空白，来自天津农学院、河南大学、江汉大学等多个国内研究机构的研究人员开展了相关研究，其成果发表在《BMC Plant Biology》上，为深入了解甘蓝型油菜的抗逆机制奠定了基础。

研究人员在本次研究中运用了多种关键技术方法。在基因筛选和鉴定方面，通过检索拟南芥（Arabidopsis thaliana）的已知 CHYR 序列，在甘蓝型油菜、白菜（Brassica rapa）和甘蓝（Brassica oleracea）基因组中进行比对搜索，从而确定相关基因。利用系统发育分析，将多个物种的 CHYR 蛋白序列合并比对，构建进化树以探究它们的亲缘关系。此外，借助染色体定位、共线性分析等技术，研究基因在染色体上的分布规律和进化关系；运用实时定量聚合酶链反应（RT-qPCR）技术，检测基因在不同胁迫处理下的表达水平变化；通过亚细胞定位和转基因技术，明确基因编码蛋白的定位和功能。

研究人员首先对甘蓝型油菜的 CHYR 基因家族进行了全面鉴定。以拟南芥的 7 个 CHYR 肽序列为查询依据，在甘蓝型油菜基因组数据库中进行 BLASTP 搜索，最终识别出 24 个 BnCHYR 基因。这些基因编码的多肽长度在 254 - 1271 个氨基酸残基之间，分子量范围为 29.82 kDa - 143.78 kDa，等电点在 5.43 - 7.43 之间，亲水性较强。通过系统发育分析，这些 BnCHYR 基因被清晰地分为三个组，与其他物种的 CHYR 分类情况一致。

接着，研究人员对 BnCHYR 基因的结构和保守基序进行了分析。BnCHYR 基因包含 9 - 14 个外显子，其中第三组（Group III）成员的编码序列（CDS）比其他两组更长。所有 BnCHYR 蛋白都含有 CHY 锌指、C₃H₂C₃型 RING 指和锌带结构域，而 Group III 成员在 N 端还额外含有 1 - 3 个血影蛋白结构域，这一结构特征可能与调节铁稳态有关。MEME 基序分析发现，24 个 BnCHYR 蛋白仅含有 3 个共同基序，不同亚家族的保守基序组成存在差异，但进化关系较近的 BnCHYR 蛋白具有更相似的保守结构域。

在染色体分布和共线性分析中，研究人员发现 24 个 BnCHYR 基因不均匀地分布在 14 条染色体上，部分染色体上存在基因串联重复现象。甘蓝型油菜的 A_n和 C_n亚基因组与相应的二倍体 A_r和 C_o基因组具有较高的共线性，大部分同源基因对在染色体上的位置相似。

对 BnCHYR 基因启动子区域的顺式作用元件分析表明，这些基因的启动子中存在多种与激素调节、胁迫响应、光响应等相关的顺式作用元件。其中，光响应元件最为丰富，其次是脱落酸（ABA）响应元件、茉莉酸甲酯（MeJA）响应元件和厌氧诱导元件。不同组甚至同一组内的基因，其顺式作用元件的类型和数量都存在较大差异，这暗示着 BnCHYR 基因在植物生长、发育和应对各种胁迫中发挥着多样化的功能。

为了探究 BnCHYR 基因在非生物胁迫下的功能，研究人员对 8 个具有代表性的 BnCHYR 基因进行了表达模式分析。通过 qRT-PCR 技术检测发现，这 8 个基因在干旱、盐、冷和热胁迫下，表达水平呈现出不同的变化趋势。热胁迫显著诱导了这些基因的表达，盐胁迫下除 BnC₀₉.CHYR.2 外，其他基因表达均上调；冷胁迫下大部分基因表达上调，但 BnA₁₀.CHYR.2 和 BnC₀₉.CHYR.1 表达受到抑制；干旱胁迫下部分基因表达上调，部分基因表达下调。这表明 BnCHYR 基因对不同胁迫的响应存在差异，在植物抵御非生物胁迫过程中发挥着不同的调控作用。

研究人员进一步对 BnA₀₃.CHYR.1 进行了功能验证。亚细胞定位分析显示，BnA₀₃.CHYR.1 蛋白定位在细胞质和细胞核中。将 BnA₀₃.CHYR.1 基因在拟南芥中过表达后，在含有 50 mmol/L NaCl 的培养基上，过表达植株的生长状况明显优于野生型植株，主根长度也显著长于野生型。这表明 BnA₀₃.CHYR.1 可能是植物应对盐胁迫的正调控因子。

在讨论部分，研究人员指出 CHYR 蛋白在植物生长、发育和应对非生物胁迫中起着至关重要的作用，不同物种的 CHYR 基因家族存在一定的保守性。尽管研究揭示了 BnA₀₃.CHYR.1 在盐胁迫中的正向调控作用，但对于其具体的调控机制，比如如何通过泛素化途径调节盐胁迫相关蛋白的稳定性，以及与其他信号通路之间的交互作用等，仍有待进一步深入研究。

综上所述，该研究全面分析了甘蓝型油菜 CHYR 基因家族的特征，明确了 BnA₀₃.CHYR.1 在盐胁迫中的功能，为进一步解析甘蓝型油菜应对非生物胁迫的分子机制提供了重要线索，也为通过基因工程手段提高甘蓝型油菜的抗逆性奠定了理论基础。