综述：甲状腺肿瘤的下一代免疫组化：诊断和分子分类应用的实践回顾

《Endocrine Pathology》：Next-Generation Immunohistochemistry in Thyroid Neoplasm: A Practical Review on the Applications in Diagnosis and Molecular Classification

甲状腺肿瘤的下一代免疫组化在诊断和分子分类中作用显著，助力精准医疗。

　　

引言

甲状腺癌是全球最常见的内分泌恶性肿瘤。癌症基因组图谱（TCGA）项目将甲状腺癌从分子层面分为 BRAF 样和 RAS 样肿瘤等类别，其中罕见的激酶基因融合相关癌大致位于中间或更靠近 BRAF 样肿瘤。甲状腺癌的分子驱动因素相互排斥，在所有肿瘤细胞中表达，且与形态和生物学行为密切相关 ，这些关键基因改变成为新兴选择性激酶抑制剂的主要靶点，重新定义了晚期和碘难治性甲状腺癌的治疗方式。此外，关键肿瘤抑制基因的种系突变与家族遗传性综合征相关，可促使甲状腺病变和肿瘤的发展。因此，在临床实践中，采用整合分子和组织病理学的方法对甲状腺肿瘤进行分类变得越来越必要。

免疫组化（IHC）在病理诊断中至关重要，可识别谱系特异性蛋白表达，展示肿瘤定义基因改变的替代生物标志物。新一代免疫组化（“next-generation IHC”）能更精确地对肿瘤分类，确定潜在治疗靶点，筛查潜在遗传性综合征患者，且成本更低、实验室周转时间更快，还不受福尔马林固定石蜡包埋肿瘤组织中核酸质量欠佳的影响，可对肿瘤细胞进行原位检测，便于病理学家将形态学与免疫组化表达直接关联。本文将探讨六种 “下一代” 免疫组化标记物在甲状腺病理学中的应用。

下一代免疫组化在诊断和靶向治疗中的应用

• BRAF^V600E（克隆 VE1）：BRAF p.V600E 突变是甲状腺乳头状癌（PTC）中最常见的分子驱动因素，占比 58.5 - 86.8%。使用突变特异性抗体克隆 VE1 可在肿瘤细胞质中检测到突变蛋白，在多种肿瘤类型（包括甲状腺癌）中具有出色的特异性（99 - 100%）和敏感性（84 - 100%）。BRAF^V600E IHC 有助于突出肿瘤范围和独特的侵袭模式（如侧管生长和孤立肿瘤簇），这些模式对预测淋巴结转移具有潜在意义 。在具有 PTC 样核变化的包膜完整或界限清晰的甲状腺肿瘤中，BRAF^V600E IHC 可作为有效的诊断工具，因为 BRAF p.V600E 突变的存在是诊断非侵袭性滤泡性甲状腺肿瘤伴乳头状样核特征（NIFTP）的重要排除标准。

在多灶性 PTC 中，BRAF^V600E IHC 可用于识别具有不同分子驱动因素（BRAF 阳性和 BRAF 阴性肿瘤）的多灶性肿瘤，但对于所有病灶均携带 BRAF p.V600E 突变的多灶性 PTC，还需进一步进行克隆性研究以明确其是真正的多中心肿瘤还是腺体内肿瘤扩散。PTC 中 BRAF 表达的亚克隆性和肿瘤内异质性存在争议，BRAF^V600E IHC 在大多数 BRAF p.V600E 突变的 PTC 中表现为均匀的细胞质染色，少数分子不一致的 PTC 除外，这有助于精准识别和区分分子不一致的 PTC 及其淋巴结转移。准确诊断具有不同分子驱动因素的多灶性 PTC，对选择合适的靶向激酶抑制剂具有重要临床意义，特别是在 10 - 15% 的晚期或放射性碘难治性 PTC 中。

在淋巴结中，BRAF^V600E IHC 可突出常规苏木精 - 伊红（H&E）评估可能遗漏的转移性孤立肿瘤细胞或簇，有助于准确的病理分期。此外，良性淋巴结内甲状腺包涵体与转移性甲状腺癌的区分存在争议，BRAF^V600E IHC 可作为客观工具进行鉴别。需要注意的是，BRAF VE1 IHC 仅用于检测 BRAF p.V600E 突变的 PTC，无法识别具有非 p.V600E BRAF 突变（如其他 I 类突变、II 和 III 类突变或 BRAF 融合）的 PTC。

• RAS^Q61R（克隆 SP174）：RAS 家族癌基因（NRAS、HRAS 和 KRAS）的突变是滤泡型肿瘤（包括滤泡性腺瘤（FA）、滤泡性甲状腺癌（FTC）、滤泡型 PTC（FVPTC））以及高级别肿瘤（如低分化甲状腺癌、未分化甲状腺癌（ATC））的关键分子事件 。NIFTP 也富含类似的 RAS 突变，RAS 突变还存在于一些原本基于形态学被归类为增生的甲状腺结节中，这些结节更应被归类为 FA。目前 WHO 内分泌和神经内分泌肿瘤分类更倾向于使用 “甲状腺滤泡结节性疾病” 这一术语，以反映对这类结节本质的新认识。在不同的 RAS 基因中，NRAS 突变最为常见，RAS 基因中最常见的突变是密码子 61 处谷氨酰胺被精氨酸取代（p.Q61R）。

滤泡型肿瘤的病理分类存在问题，观察者之间对 NIFTP、侵袭性包膜内 FVPTC 与 FA、FTC 的形态学区分存在较大差异，且这种区分的临床意义也存在争议。TCGA 项目将 PTC 分为 RAS 样和 BRAF 样 PTC，表明大多数侵袭性包膜内 FVPTC 和 NIFTP 属于 RAS 样肿瘤，应与 BRAF 样 PTC 区分开来。使用下一代免疫组化检测 RAS 突变，有助于将形态学不明确的滤泡型肿瘤分类为更具临床意义的组别，减少形态学解释的主观性。此外，确定为 RAS 样滤泡型肿瘤后，关注其结构对评估包膜和 / 或血管侵袭至关重要，免疫组化可辅助这一评估过程。

商业可用的抗体 SP174 能有效检测 RAS p.Q61R 蛋白，在肿瘤细胞中呈现均匀的中等到强颗粒状细胞质和 / 或膜染色。其对识别所有三种 RAS 基因中的 Q61R 突变具有高敏感性（90.6%）和特异性（92.3%）。在诊断滤泡型癌时，RAS^Q61R IHC 可用于界定肿瘤边界、浸润、包膜和 / 或血管侵袭以及多灶性，对确诊微侵袭性 FTC 非常有价值，还能区分 FA 与具有侵袭性卫星结节的 FTC，确认具有平淡细胞形态特征的转移性或复发性滤泡型肿瘤的肿瘤性质，识别由 RAS 突变的滤泡型肿瘤和其他 RAS 阴性肿瘤组成的碰撞瘤。在散发性甲状腺髓样癌（MTC）中，高达 20% 的病例存在 RAS 家族基因的互斥性改变，最常见的是 HRAS p.Q61R 突变。RAS^Q61R IHC 在检测散发性 MTC 的 RAS p.Q61R 突变时具有出色的敏感性、特异性、阳性预测值和阴性预测值，可作为筛查手段，帮助确定是否需要进行 RET 种系检测。

• pan - TRK（克隆 EPR 17341）：NTRK 基因重排在 2.3 - 3.4% 的 PTC 中存在，最常见的基因融合是 ETV6::NTRK3。pan - TRK IHC（克隆 EPR 17341）在组织微阵列中检测 BRAF^V600E阴性 PTC 中的 NTRK 1/3 重排时，特异性为 100%，敏感性为 41.7% 。综合分析显示，其检测 NTRK3 重排的敏感性（65.8%）低于检测 NTRK1 重排（87.5%）。pan - TRK IHC 在 NTRK 重排的 PTC 中染色模式多样，ETV6::NTRK3 融合相关的 PTC 通常在细胞质和细胞核中呈现局灶性、有限的染色，染色强度不一；非 ETV6::NTRK3 病例则常呈现更均匀、弥漫的染色模式，通常在细胞质中，可能伴有或不伴有膜染色减弱。ETV6::NTRK3 融合相关 PTC 的异质性染色模式在肿瘤周边较强，向中心逐渐减弱，可能被误认为是人为假象，病理学家在解读有限活检样本的 pan - TRK IHC 结果时应注意这一点，避免出现假阴性。NTRK 重排的 PTC 往往表现出非经典组织学特征，如富含微滤泡、多结节浸润性生长、肿瘤内密集硬化和细微的核特征，诊断具有挑战性。pan - TRK IHC 是一种低成本的检测方法，可用于识别这些病例，后续需进一步进行分子确认。
• ALK（克隆 5A4 或 D5F3）：ALK 基因重排在 1.2% 的 PTC 中存在，最常见的是 STRN::ALK（45.8%）和 EML4::ALK（31.4%）。抗体克隆 5A4 在检测 PTC 中的 ALK 基因重排时，敏感性为 100%，特异性为 75%，表现为肿瘤细胞质中的弥漫性表达。使用 D5F3 克隆也成功鉴定出 ALK 重排的 PTC，部分经靶向 RNA 下一代测序（NGS）证实，特异性达 100%。ALK 基因融合相关的甲状腺癌可能具有与 RAS 样肿瘤相似的细微细胞学核特征，且呈现多种结构模式，如经典型、以微滤泡生长为主的经典型、浸润性滤泡型和实性小梁型等。部分肿瘤界限清晰但细胞具有异质性，同时存在明显的 PTC 核变化和细微或 RAS 样核特征的细胞。因此，在没有 ALK IHC 辅助的情况下，识别 ALK 重排的 PTC 具有一定难度。
• 下一代免疫组化在 ATC 中的应用：ATC 是甲状腺癌中最致命的类型，全球发病率为 1 - 4%，生存率极低。ATC 可新发，也可伴发于分化良好或低分化的甲状腺癌。ATC 早期存在 BRAF p.V600E（25.9 - 45.0%）和 RAS 突变（24.0 - 40.7%），TP53（40 - 80%）和 TERT 启动子突变（30 - 75%）是后期常见的基因改变 。BRAF p.V600E 突变与 ATC 表现为鳞状细胞癌表型和 / 或伴发 PTC 显著相关。使用下一代免疫组化检测 BRAF^V600E和 RAS^Q61R可识别 ATC 的分子驱动因素，肿瘤细胞质中呈现弥漫性弱至中等表达。当 ATC 与分化良好的甲状腺癌并存时，两种成分通常均有染色，但 ATC 成分的表达可能会减弱，尤其是在以肉瘤样分化为主的病例中。对于染色不明确的病例，建议进行分子确认。目前指南推荐所有 ATC 患者进行快速肿瘤突变检测，包括使用经过严格验证的 BRAF p.V600E 突变特异性免疫组化作为初始筛查工具，随后进行快速 NGS 以识别其他可靶向的生物标志物，特别是在 BRAF 阴性的病例中。早期检测出 BRAF p.V600E 突变的 ATC 至关重要，因为 BRAF 和 MEK 抑制剂联合治疗可带来显著的临床益处，应尽早开始。此外，也有 ALK 重排和 NTRK 重排的 ATC 对相应靶向药物有反应的报道，凸显了通过下一代免疫组化和 NGS 检测这些改变以指导靶向治疗的重要性。

下一代免疫组化在诊断和遗传性综合征中的应用

• PTEN：PTEN 错构瘤肿瘤综合征（PHTS）是一种罕见的常染色体显性综合征，估计患病率约为 1:200,000，由 PTEN 肿瘤抑制基因（10q23.31）或其他功能相关基因（如 PIK3CA、AKT1）的种系失活突变或缺失引起，导致 PI3K/AKT/mTOR 信号通路上调，促进细胞增殖、迁移、存活、血管生成并减少细胞凋亡。PHTS 涵盖多种综合征，如考登综合征（Cowden syndrome）、班纳扬 - 莱利 - 鲁瓦尔卡巴综合征（Bannayan - Riley - Ruvalcaba syndrome）和普洛透斯综合征（Proteus syndrome），其特征为多种组织错构瘤，且患良性和恶性肿瘤（尤其是乳腺、子宫内膜和甲状腺肿瘤）的终身风险增加。在甲状腺中，PHTS 表现为多个双侧细胞性结节，具有多种良性和恶性形态，可能伴有脂肪浸润、C 细胞增生和淋巴细胞性甲状腺炎等特征。PHTS 中的腺瘤可能进展为癌，患者患甲状腺癌的终身风险为 14 - 38%。因此，识别受影响的家族对于监测和潜在的预防性甲状腺切除术至关重要。在与 PHTS 相关的甲状腺结节中，种系突变伴随着野生型 PTEN 等位基因的二次体细胞改变，导致 PTEN 蛋白表达缺失，可通过免疫组化检测到。PTEN 免疫组化表达缺失对 PHTS 具有较高的敏感性（100%）和特异性（92.3%），但仍需进一步临床检查和确认。此外，PTEN 失活突变在 5 - 10% 的散发性 FTC 和部分高级别甲状腺癌中是驱动性改变。在结节中，PTEN 免疫组化表达缺失时，背景正常滤泡细胞和内皮细胞仍保留表达，可作为内部阳性对照。
• β - catenin：家族性腺瘤性息肉病（FAP）是一种罕见的常染色体显性综合征，患病率为 1:8000 - 10,000，由 APC 肿瘤抑制基因（5q22.2）的种系失活突变引起，易导致多发性结直肠腺瘤，几乎必然会发展为结直肠腺癌，同时增加患其他肿瘤（包括筛状桑葚状甲状腺癌（CMTC））的风险 。虽然 CMTC 可散发，但 39 - 53% 的病例与 FAP 相关。在部分患者中，CMTC 在 FAP 被识别之前就被诊断出来，凸显了其准确诊断的重要性。CMTC 以前被归类为 PTC 的一种变体，现在因其独特的形态学、免疫表型和分子特征被认为是一种独立的实体。CMTC 主要影响年轻女性，通常界限清晰、有包膜。组织学上，它呈现乳头、滤泡、筛状、小梁和实性生长模式的混合，伴有特征性的鳞状桑葚体，不形成胶体，PTC 的核特征可变。散发性 CMTC 通常为单发，而 FAP 相关的 CMTC 往往较小、多发且双侧发生。CMTC 表达 TTF - 1，雌激素和孕激素受体呈阳性，但甲状腺球蛋白阴性，PAX8 阴性或弱阳性，表明其缺乏明确的滤泡细胞分化。分子层面，CMTC 由 Wnt/β - catenin 通路的基因改变驱动。在 FAP 相关的多中心肿瘤中，常见 APC 基因的二次体细胞突变，也有 KMT2C 和 KMT2D 改变的报道；散发性病例则存在功能等效基因（如 APC（外显子 15）、CTNNB1（外显子 3）和 AXIN1（外显子 1 和 7））的体细胞突变。CMTC 的一个关键分子特征是 β - catenin 异常积累，伴随细胞质和随后的核转位，免疫组化显示肿瘤细胞中强弥漫性核和细胞质染色，与正常滤泡细胞和其他甲状腺肿瘤的膜染色模式形成对比。因此，β - catenin IHC 对诊断散发性和家族性 CMTC 至关重要，有助于识别 FAP 患者。基于这些特征，CMTC 在最新的 WHO 分类中被重新归类为独立于 PTC 的实体，归属于 “组织发生不确定的甲状腺肿瘤” 组。此外，区分 CMTC 与 PTC 具有临床意义，因为 CMTC 缺乏明确的滤泡细胞分化，质疑了血清甲状腺球蛋白测量用于肿瘤监测和放射性碘相关辅助治疗的潜在益处。

β - catenin 还有助于诊断罕见的伴有纤维瘤病 / 筋膜炎样 / 韧带样型间质的 PTC。这种双相肿瘤亚型由常规 PTC 与类似瘢痕、结节性筋膜炎或韧带样型纤维瘤病的细胞形态温和的成纤维细胞 - 肌成纤维细胞增殖紧密混合而成。梭形细胞表达 SMA，但不表达 PAX8、TTF - 1、甲状腺球蛋白和全细胞角蛋白。作为其特征，梭形细胞在 β - catenin IHC 中表现出强烈的核和细胞质表达，这与大多数病例中存在的 CTNNB1 突变相对应。这些特征有助于将该肿瘤与起源于 PTC 的梭形细胞和少细胞性未分化甲状腺癌区分开来。虽然该肿瘤的治疗与常规 PTC 相似，但准确诊断具有临床意义，因为韧带样纤维瘤病间质可能对碘治疗无反应，且可能需要更宽的手术切缘以防止复发，其转移通常由间质成分组成，可能会在复发时导致进一步的诊断问题。

结论

BRAF^V600E、RAS^Q61R、pan - TRK、ALK、PTEN 和 β - catenin 的下一代免疫组化在甲状腺癌的诊断和分子分类中具有重要作用。在分化良好的甲状腺癌中，这些染色可突出肿瘤范围、侵袭和淋巴结受累情况，区分良性淋巴结内甲状腺包涵体与转移性肿瘤沉积物，识别具有不同分子驱动因素的多中心甲状腺癌或碰撞瘤，并筛查潜在的遗传性综合征患者。在 ATC 中，这些染色可快速准确地识别潜在的分子驱动因素，彻底改变了这种侵袭性恶性肿瘤的治疗方式。总体而言，这些进展提高了诊断准确性，有助于精确的病理分期和风险分层，支持为晚期或放射性碘难治性疾病选择合适的靶向治疗，改善了遗传性综合征患者的筛查和管理。这些工具还为<