比较基因组学揭示乳酸菌碳水化合物利用能力的遗传基础

《Discover Bacteria》：Comparative genomic analysis of selected lactic acid bacteria and phenotypic association of the key genes involved in fructan and ribose utilisation

通过对31株乳酸菌的比较基因组学分析，研究人员揭示了其在碳水化合物利用上的遗传多样性，并成功关联了特定基因簇与果聚糖和核糖利用表型，为乳酸菌在食品工业中的应用提供了新的理论依据，推动了对乳酸菌基因型-表型关系的理解（LAB; GTM）。

　　乳酸菌（LAB）在食品工业中具有重要应用价值，因其能够利用多种碳水化合物并产生有机酸，从而延长食品保质期并改善其品质。然而，传统方法筛选具有特定表型的菌株耗时费力，且仅基于基因组分析预测表型存在局限性。为此，研究人员开展了对31株乳酸菌的比较基因组学和基因型-表型关联（GTM）研究，旨在深入探究其碳水化合物利用能力的遗传基础，并为菌株筛选和工业应用提供更高效的策略。研究结果揭示了乳酸菌在种内和种间均存在显著的碳水化合物利用多样性，并发现了与果聚糖和核糖利用相关的遗传簇，为未来乳酸菌的基因组和功能研究奠定了基础，有助于推动食品生物加工领域的创新和可持续发展。

乳酸菌（LAB）是一类广泛存在于人类、动物、昆虫的胃肠道以及植物和动物源性食品、土壤和水中的微生物。它们在食品生物加工中发挥着重要作用，不仅可以实现生物保鲜、增强感官属性、改善膳食品质，还能促进人类健康。由于乳酸菌被认为是安全的（GRAS），并被列入合格假定安全（QPS）名单，因此它们成为食品生物加工中的理想候选菌株。乳酸菌能够利用多种碳水化合物，并在发酵过程中降低pH值，从而延长食品保质期并减少人工防腐剂的使用。此外，乳酸菌还可用于生产功能性食品，如无乳糖或低FODMAP产品，满足特定饮食需求消费者的需要。在食品工业中，利用乳酸菌驱动的生物加工符合全球粮食安全和可持续发展的目标，通过将工业生物废料转化为高附加值产品，减少食品生产对环境的影响。

本研究聚焦于三种乳酸菌：Lacticaseibacillus paracasei（L. paracasei）、Lactiplantibacillus plantarum（L. plantarum）和Pediococcus pentosaceus（P. pentosaceus），这些菌种通常与食品发酵相关，其中L. plantarum和P. pentosaceus多见于植物基产品，而L. paracasei主要与乳制品发酵相关。研究人员通过对这些菌种的31株菌进行基因组测序，并开展了基因型-表型关联（GTM）分析，以确定与特定碳水化合物利用表型相关的基因。研究发现，这些菌株在碳水化合物利用上表现出显著的种内和种间多样性，并为乳酸菌进化过程中基因丢失和水平基因转移提供了间接证据。GTM分析成功识别了L. paracasei中与核糖利用相关的遗传簇，以及L. paracasei和P. pentosaceus中与果聚糖利用相关的fosABCDXE操纵子，这些发现为深入理解乳酸菌的遗传多样性和特定表型之间的复杂联系奠定了基础。

在研究方法方面，研究人员首先从不同来源获取了L. paracasei（4株）、L. plantarum（12株）和P. pentosaceus（15株）菌株，并在MRS5培养基中进行常规培养。随后，对这些菌株在23种碳水化合物（包括单糖、糖醇、二糖、寡糖和多糖）上的生长能力进行了表型分析，通过测量光学密度（OD₆₀₀）来评估菌株的生长情况，并利用RStudio软件进行数据分析，生成了生长曲线和热图，以直观展示不同菌株在碳水化合物利用上的差异。在基因组测序和组装方面，研究人员使用GenElute细菌基因组DNA试剂盒提取DNA，并通过Illumina测序平台进行测序，利用SPAdes软件进行基因组组装，并通过CheckM评估基因组的完整性和污染情况。此外，研究人员还利用Prokka软件进行基因注释，并结合了来自GenBank的多种参考菌株蛋白序列和Pfam数据库信息。在比较基因组学分析中，研究人员使用ROARY平台计算泛基因组，并利用BLASTP比对和Markov Cluster算法（MCL）对基因家族进行分类，将其划分为核心基因组和可变基因组。最后，通过GTM分析将实验确定的生长表型与基因的存在或缺失进行关联，以识别与特定碳水化合物利用相关的基因簇。

研究结果显示，L. paracasei的4个草图基因组contigs数量为52至169，N50值较高（46,151–181,213 bp），平均基因组长度为2,956,027 bp，GC含量为46.3%，与NCBI分类一致。这些草图基因组的完整度高（98.91%至99.46%），未检测到污染。与参考菌株L. paracasei DSM 5622的平均核苷酸一致性（ANI）大于98.9%，证实了正确的物种鉴定。尽管这些菌株来源相对单一，但其泛基因组包含4,327个同源群（OGs），其中核心基因组有1,940个OGs。L. plantarum的12个高质量草图基因组contigs数量较少（中位数为54），N50值较高（中位数为204,062 bp），平均基因组长度为3,279,901 bp，GC含量为44%。这些草图基因组的完整度在99.07%至99.38%之间，污染水平在2.16%至3.40%之间。与参考菌株L. plantarum DSM 20174的ANI值均大于99%，确认了准确的物种鉴定。P. pentosaceus的15个基因组组装contigs数量较少（中位数为12），N50指数较高（中位数为332,119 bp），平均基因组长度为1,822,122 bp，GC含量为37%，与NCBI分类一致。这些草图基因组的完整度超过99%，污染水平在0%至0.15%之间。与参考菌株P. pentosaceus DSM20336的ANI值大于99%，进一步确认了正确的物种分类。

在碳水化合物利用的表型特征方面，研究人员发现，尽管菌株的表型特征与分离来源关系不大，但不同菌株之间存在显著的种内和种间多样性。所有菌株均能在不同程度上利用单糖中的半乳糖和果糖，以及二糖中的麦芽糖、海藻糖和纤维二糖。然而，P. pentosaceus YP2.7.1.4.A在利用葡萄糖和麦芽糖、海藻糖、纤维二糖等葡萄糖二糖时表现出有限的生长能力。尽管如此，研究人员在所有分析的基因组中均发现了葡萄糖-6-磷酸异构酶（EC 5.3.1.9）和磷酸转移酶系统（PTS）糖转运蛋白亚基IIA（EC 2.7.1.199），这些基因被认为对乳酸菌中葡萄糖的转运和利用至关重要。这种有限的碳水化合物利用能力可能是由于基因缺失之外的原因造成的，例如点突变。在聚醇（糖醇）的利用上，不同菌株之间也表现出较大的种间差异。大多数L. plantarum菌株能够发酵甘露醇（R27除外）和山梨醇（GP3.7.1.3.A除外），但只有FST1.9菌株在麦芽醇上表现出微弱的生长。所有L. paracasei菌株均能在甘露醇上生长，其中两种菌株能在山梨醇上生长，三种菌株能在麦芽醇上生长。P. pentosaceus YP2.7.1.4.A是利用甘露醇能力最强的Pediococcus菌株，而其他Pediococcus菌株中只有RYE104能够利用甘露醇。这些发现与之前的研究一致，表明甘露醇是乳酸菌中最常发酵的糖醇，其次是山梨醇。乳酸菌的生态位适应性导致基因丢失或失活，以及通过水平基因转移获得关键基因，因此在