CYLD：脓毒症致急性肺损伤治疗的新希望

《Cellular and Molecular Life Sciences》：CYLD links the TRAF6/sNASP axis to TLR4 signaling in sepsis-induced acute lung injury

研究人员针对脓毒症致急性肺损伤展开研究，发现 CYLD 可缓解炎症，或为治疗提供新靶点。

　　脓毒症，这个如同隐藏在暗处的 “杀手”，时刻威胁着人类的健康。它是由身体对细菌、病毒等病原微生物的系统性炎症反应引发的危及生命的多器官衰竭。全球成年脓毒症住院患者的总体死亡率高达 26.7%，而在重症监护病房（ICU），这一数字更是飙升至 41.9%。如此高的死亡率和住院率，给全球经济带来了沉重的负担。在脓毒症的进程中，肺部首当其冲，常常遭受急性肺损伤（ALI）的侵袭。患者肺部因炎症而气体交换功能减弱，进而引发肺水肿和呼吸衰竭，病理过程涉及肺泡屏障功能破坏、肺血管内皮损伤以及肺毛细血管液体过度渗漏到肺泡腔等。

目前，针对脓毒症诱导的 ALI 缺乏有效的治疗手段，这使得探寻其发病机制和潜在治疗靶点迫在眉睫。众多研究表明，炎症因子的表达在加重肺水肿和促进 ALI 发生发展中起着关键作用，因此，控制肺泡炎症成为预防 ALI 发生和减轻其严重程度的关键。此前研究发现，脂多糖（LPS，革兰氏阴性菌外膜的主要成分）可通过与 Toll 样受体 4（TLR4）相互作用，激活肿瘤坏死因子受体相关因子 6（TRAF6）以及核因子（NF）-κB 信号通路，从而调节促炎细胞因子的产生，引发肺损伤。同时，体细胞核对精子自身抗原蛋白（sNASP）与 TRAF6 的结合是抑制 TRAF6 激活的关键步骤，但 sNASP 调节 TRAF6 激活和炎症性肺损伤的分子机制仍不明确。此外，去泛素化酶在这一过程中的作用也尚不清楚。

为了揭开这些谜团，来自台北医学大学和美国阿肯色大学医学科学中心的研究人员展开了深入研究。他们的研究成果发表在《Cellular and Molecular Life Sciences》上，为脓毒症诱导的 ALI 治疗带来了新的希望。

研究人员在实验过程中运用了多种关键技术方法。在细胞实验方面，培养了 HEK293、THP-1 细胞以及原代骨髓来源的巨噬细胞（BMDMs）。通过 RNA 干扰技术，使用针对特定基因的小干扰（si）RNAs 来敲低相关基因的表达；采用质粒转染技术，将表达特定蛋白的质粒导入细胞。利用免疫沉淀（IP）和免疫印迹（IB）技术，检测蛋白质之间的相互作用和蛋白质的表达水平；运用体外结合实验，探究蛋白质在体外的相互作用。通过实时聚合酶链反应（PCR）和酶联免疫吸附测定（ELISA），检测细胞因子的表达水平。在动物实验中，构建了盲肠结扎穿孔（CLP）动物模型模拟脓毒症，还使用了重组腺病毒感染小鼠，以研究相关基因在体内的功能。

下面来看看具体的研究结果：

• CYLD 与 sNASP 直接相互作用：研究人员通过实验发现，在 HEK293 细胞中，GFP-sNASP 与 CYLD 结合，而非 A20；在 THP-1 细胞中，内源性 CYLD 与 sNASP 或 TRAF6 相互作用。并且，沉默 sNASP 会完全消除 CYLD 与 TRAF6 的相互作用，而沉默 TRAF6 不影响 sNASP 与 CYLD 的相互作用，这表明 sNASP 是形成 CYLD 和 TRAF6 复合物的关键衔接蛋白。
• CYLD 通过 sNASP 抑制 TRAF6 多聚泛素化：下调 CYLD 会使 TRAF6 泛素化水平增加，且敲低 CYLD 会消除 sNASP 对 TRAF6 自泛素化的抑制作用。而过表达 CYLD^WT（野生型），而非突变体，可恢复 sNASP 对 TRAF6 多聚泛素化的负调节功能，揭示了 sNASP 将 TRAF6 和 CYLD 聚集在一起调节 TRAF6 多聚泛素化的新机制。
• CYLD 负向调节 sNASP 介导的促炎细胞因子反应：沉默 CYLD 会显著增强 LPS 诱导的 IL-6 和 TNF-α 在 mRNA 和蛋白质水平的表达。过表达 CYLD 可显著降低 LPS 诱导的 TNF-α 和 IL-6 的转录和翻译水平，但当 sNASP 下调时，CYLD 对 TNF-α 和 IL-6 产生的抑制作用消失，说明 sNASP 是 CYLD 介导的抑制 LPS 诱导的促炎细胞因子产生的关键因素。
• PP4 对 sNASP 的去磷酸化是 sNASP/TRAF6/CYLD 复合物形成所必需的：LPS 处理后，sNASP 发生丝氨酸磷酸化，导致 CYLD 与 sNASP 解离，这一现象在体外实验中也得到验证，即 CYLD 重组蛋白仅在 sNASP 未被磷酸化时与之相互作用。敲低 PP4 会阻止 CYLD/sNASP/TRAF6 复合物的恢复，表明 PP4 对该复合物的稳态至关重要。
• CYLD 参与 PP4 抑制 TRAF6 多聚泛素化过程：过表达 PP4 可显著降低 TRAF6 的自泛素化水平，而敲低 CYLD 会增加 PP4 过表达的 THP-1 细胞中 TRAF6 的多聚泛素化水平。在细胞因子检测实验中，PP4 过表达可显著降低 LPS 诱导的 TNF-α 和 IL-6 在 mRNA 和蛋白质水平的表达，但敲低 CYLD 会消除 PP4 的这种抑制作用，说明 CYLD 和 PP4 的协同作用对调节 TLR4 介导的促炎细胞因子表达至关重要。
• CYLD 在原代 BMDMs 中与 sNASP/TRAF6 复合物相互作用并负向调节促炎细胞因子：在原代 BMDMs 中，LPS 刺激后，内源性 CYLD 在 2 小时后与 sNASP/TRAF6 复合物解离，且与丝氨酸特异性磷酸化增加相关。过表达 CYLD^WT的 BMDMs 中，TNF-α 和 IL-6 显著减少，但敲除 sNASP 或 PP4 会消除 CYLD 的这种抑制作用，表明 sNASP 和 PP4 是 CYLD 抑制 LPS 触发的人巨噬细胞促炎细胞因子产生所必需的。
• CYLD 减轻脓毒症诱导的肺部病理变化：在脓毒症诱导的小鼠 ALI 模型中，Ad-CYLD^WT处理的小鼠肺部炎症细胞积聚和肺泡组织结构破坏明显减轻，肺组织中 TNF-α、IL-6 和 IL-1β 的 mRNA 表达以及外周血血清中这些细胞因子的蛋白质水平均显著降低，而 Ad-CYLD^mut处理的小鼠则无此效果，证明 CYLD 可显著减轻 LPS 诱导的肺部病理损伤和炎症反应。

综合研究结论和讨论部分，这项研究揭示了 CYLD 在脓毒症诱导的肺部炎症反应中的新抗炎机制。在未受刺激状态下，CYLD 与 TRAF6/sNASP 复合物结合，维持免疫稳态；LPS 刺激后，CYLD 从磷酸化的 sNASP 上解离，使 TRAF6 激活下游 NF-κB 和促炎细胞因子基因；感染后期，CYLD 重新与 TRAF6/sNASP 复合物结合，抑制 TRAF6 激活，终止感染诱导的肺部炎症。这一发现表明 CYLD 在脓毒症诱导的炎症反应中具有抑制作用，有望成为治疗细菌性感染引起的肺炎的潜在药物靶点，为脓毒症诱导的 ALI 治疗提供了新的方向和理论依据，对推动相关领域的研究和临床治疗发展具有重要意义。