纤维素酶AaCel5A的结构与功能研究：揭示其在短纤维二糖水解中的关键作用

《AMB Express》：His70 of Acetivibrio alkalicellulosi Cel5A is important for efficient hydrolysis of short cellodextrins

本研究聚焦于纤维素酶AaCel5A，通过结构引导的工程改造，发现其第70位组氨酸（His70）在短纤维二糖的高效水解中发挥重要作用，为纤维素酶的作用机制提供了新的见解，具有重要的工业应用前景。

　　纤维素是地球上最丰富的可再生多糖，其水解产生的葡萄糖可用于生产高附加值的生物商品。然而，纤维素酶在水解短纤维二糖时的效率仍有待提高。为了解决这一问题，天津科技大学和中国科学院天津工业生物技术研究所的研究人员对一种来自碱性细菌Acetivibrio alkalicellulosi的过程性内切葡聚糖酶AaCel5A进行了深入研究。该酶包含一个糖苷水解酶家族5（GH5）结构域和两个串联的碳水化合物结合模块家族6（CBM6）结构域。研究人员通过结构引导的工程改造，意外地发现了一个之前未被充分研究但相对保守的组氨酸残基（His70），它在短纤维二糖（如纤维三糖、纤维四糖和纤维五糖）的高效水解中发挥重要作用，可能通过协调底物结合来实现。该研究不仅揭示了GH5家族过程性内切葡聚糖酶在短纤维二糖水解中的作用机制，还为纤维素酶的工程改造提供了新的靶点，具有重要的工业应用前景。论文发表在《AMB Express》上。

研究人员主要采用了以下技术方法：（1）基因克隆与蛋白纯化，通过重叠延伸PCR和 Gibson 组装技术构建表达载体，并在大肠杆菌中表达目标蛋白；（2）酶活性测定，采用苯酚-硫酸法、二硝基水杨酸（DNS）法和双缩脲（BCA）法等方法测定酶活性；（3）X射线晶体学，解析了AaCel5A GH5结构域的晶体结构；（4）分子对接，利用AutoDock 4.2和AutoDock Vina将纤维五糖类似物SDP5对接到AaCel5A GH5结构域中；（5）酶的进程性测定，通过滤纸实验测定AaCel5A的进程性；（6）高效液相色谱（HPLC）分析，用于分析不同纤维素底物的水解产物；（7）定点突变，通过定点突变技术引入突变并分析其对酶活性的影响。

研究人员首先对AaCel5A的酶活性进行了测定，发现其在55°C时活性最高，且在pH 5-10范围内具有广泛的pH耐受性。通过滤纸实验，证实了AaCel5A是一种进程性内切葡聚糖酶。与商业纤维素酶AcEndo相比，AaCel5A在摩尔基础上对再生无定形纤维素（RAC）和Avicel的水解能力并不逊色。研究人员进一步解析了AaCel5A GH5结构域的晶体结构，发现其整体折叠呈（α/β）8桶状结构，且处于开放构象。通过分子对接，预测了可能参与底物结合的氨基酸残基，包括His70。研究人员对His70进行了定点突变，发现His70在短纤维二糖的水解中发挥重要作用。与野生型相比，His70的突变体在水解短纤维二糖时表现出明显的缺陷，导致纤维四糖和纤维三糖的积累。通过HPLC分析，研究人员发现野生型AaCel5A在水解纤维三糖、纤维四糖和纤维五糖时的活性高于突变体。这些结果表明，His70通过协调底物结合在短纤维二糖的水解中发挥关键作用。

本研究的结论强调了His70在短纤维二糖水解中的重要性，并为纤维素酶的作用机制提供了新的见解。这些发现不仅有助于深入理解纤维素酶的催化机制，还为通过工程改造提高纤维素酶的水解效率提供了新的策略，具有重要的工业应用前景。