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推荐阅读：本文聚焦 tau 蛋白相关疾病，研究发现经 2′-O，4′-C - 乙烯桥核酸（ENA）修饰的反义寡核苷酸（ASO）——EN-06，可纠正 4R-tau/3R-tau 比例，改善疾病表型，且半衰期长、疗效持久，为 4R-tau 相关的 tauopathies 疾病治疗带来新方向。
### 研究背景
tau 蛋白作为一种微管结合蛋白，与阿尔茨海默病（AD）、额颞叶痴呆（frontotemporal lobar degeneration，FTLD）、进行性核上性麻痹（progressive supranuclear palsy，PSP）和皮质基底节变性（cortico - basal degeneration，CBD）等 tau 蛋白相关疾病紧密相连。在这些疾病中，FTLD、PSP 和 CBD 患者大脑中 4R-tau/3R-tau 的比例显著升高，被统称为 4R tauopathy。目前针对 tauopathies 的治疗手段大多处于临床前或探索阶段，仅有少数进入 III 期临床试验。
此前研究表明，FUS 或 SFPQ 功能缺失会导致 4R-tau 积累，进而引发 FTLD 样行为和神经退行性变。同时，调节 4R-tau/3R-tau 比例失衡对治疗 4R tauopathy 具有重要意义。反义寡核苷酸（antisense oligonucleotides，ASO）可影响可变剪接和基因沉默，已被用作疾病修饰剂。2′-O - 甲氧基乙基（2′-O-methoxyethyl，MOE）修饰的 ASO 在治疗脊髓性肌萎缩症（spinal muscular atrophy，SMA）等疾病中展现出一定疗效，但在降低 tauopathy 表型方面的效果尚未得到充分验证。为了更有效地调节 MAPT 基因的可变剪接，研究人员开发了 ENA 修饰的 ASO，旨在减少 4R-tau 水平的同时，维持总 tau 表达，避免对神经元功能产生负面影响。
实验设计
- ENA 修饰的反义寡核苷酸设计与筛选：利用 ENA 的高亲和力结合特性，设计针对人类 MAPT 外显子 10 及其侧翼内含子区域的 ENA 修饰 ASO。通过在 HEK293 细胞中的初步筛选，选取 13 种可能诱导外显子 10 跳跃或促进其包含的 ASO，以及 4 种 scrambled ASO 作为对照。将这些 ASO 分别导入 HEK293 细胞，采用半定量放射性标记 RT-PCR 分析其对 MAPT 外显子 10 可变剪接的影响。结果显示，6 种 ASO（EN-02～07）可使包含外显子 10 的转录本比例相较于未转染对照组降低 80% 以上，而 2 种 ASO（EN-11 和 EN-12）则使外显子 10 包含比例增加 50% 以上。基于体外筛选结果，选取 EN-02、EN-03 和 EN-06 进行体内筛选。
- 动物实验模型建立与处理：选用 TAU KO; hT-PAC-N 小鼠，该小鼠可产生正常人类 tau 基因（MAPT），但不产生内源性小鼠 tau。对 6 周龄的 hTau 小鼠进行脑室注射（intracerebroventricular，ICV），分别给予不同剂量的 EN-06（0 - 200μg）、对照 ASO（EN-Ctrl）或生理盐水。在注射后的不同时间点（2、6、12、24 周等），收集小鼠的大脑、肝脏、肾脏等组织样本，用于后续分析。同时，通过立体定位注射腺相关病毒（adeno - associated virus，AAV）表达针对内源性小鼠 FUS 的短发夹 RNA（short hairpin RNA，shRNA），构建 FUS 沉默的 hTau 小鼠模型（AAV-shFUS），对照组则注射对照 AAV（AAV-shCtrl）。
- 体外细胞实验：使用人类诱导多能干细胞（human-induced pluripotent stem cell，iPSC）衍生的神经元，通过慢病毒表达针对内源性 FUS 的 shRNA 降低 FUS 表达，随后用 EN-06 处理 7 天，检测 4R-tau/3R-tau 比例的变化，同时分析 EN-06 对神经元分化相关基因表达的影响。
实验结果
- EN-06 的筛选与优化：体内实验结果表明，EN-02、EN-03 和 EN-06 在注射 6 周后，均可显著降低大脑中包含外显子 10 的转录本比例，其中 EN-06 在降低 4R-tau 的同时，能较好地维持总 tau 表达，因此被选定进行深入的体内研究。进一步对 EN-06 进行剂量优化，发现 50μg 的 EN-06 在诱导 MAPT 外显子 10 跳跃方面效果最佳，且不会引起明显的急性毒性和神经炎症。
- EN-06 的体内作用持续时间与分布：单次 ICV 注射 50μg EN-06 后，其在小鼠大脑中的作用可持续 24 周，通过 RT-PCR 和免疫印迹分析发现，外显子 10 跳跃现象持续存在。EN-06 在大脑中广泛分布，且在海马体中浓度最高，其在大脑中的半衰期约为 6 个月。通过液相色谱 - 质谱（liquid chromatography - mass spectrometry，LC-MS）分析发现，EN-06 在肝脏和肾脏中的浓度在注射后逐渐降低，且半衰期较短，分别为 4.7 周和 8.4 周，同时未检测到其对肝脏和肾脏功能的明显损害。
- EN-06 对 FUS 沉默模型的影响：在 FUS 沉默的 hTau 小鼠模型中，EN-06 可有效诱导 MAPT 外显子 10 跳跃，使 4R-tau/3R-tau 比例恢复正常，且不显著改变总 tau 水平。行为学分析显示，EN-06 改善了 FUS 沉默导致的异常行为，如在高架十字迷宫实验中，减少了小鼠在开放臂的进入次数，在进食行为分析中，纠正了固定进食的异常模式。此外，EN-06 还改善了早期的突触异常，使海马体 CA1 区树突棘的成熟比例恢复正常，同时缓解了晚期的神经退行性变，减少了海马体萎缩和神经元丢失，降低了 tau 蛋白的磷酸化水平。
- ENA 修饰与 MOE 修饰 ASO 的比较：与 MOE 修饰的 ASO（MO-06）相比，ENA 修饰的 EN-06 在体外和体内实验中均表现出更强的诱导 MAPT 外显子 10 跳跃的能力，且作用持续时间更长。在 hTau 小鼠中，EN-06 诱导的 4R-tau/3R-tau 比例降低可持续 100 周，而 MO-06 的最大效果仅持续 6 周，24 周后便恢复到对照水平。同时，EN-06 和 MO-06 在引发神经炎症方面的差异不显著，两者在注射后对大脑中炎症标记基因 Aif1 的表达影响相似。
研究结论
本研究表明，ENA 修饰的 ASO——EN-06，在调节 MAPT 外显子 10 剪接、纠正 4R-tau/3R-tau 比例失衡方面表现出显著效果。单次 ICV 注射 EN-06 可长期改善 FTLD 样症状，且具有良好的安全性和耐受性。相较于 MOE 修饰的 ASO，EN-06 在调节 tau 异构体比例方面更具优势，其长效性和高效性为 4R-tau 相关的 tauopathies 疾病治疗提供了新的潜在策略。然而，tauopathies 疾病的临床多样性和缺乏精准诊断测试可能会对 EN-06 的治疗应用带来挑战，未来需要进一步开发相关诊断生物标志物，以推动基于 ASO 的治疗策略在临床中的应用。此外，还需进行更多高剂量的临床前研究，以更全面评估 EN-06 的安全性和有效性，为开展人体临床试验奠定基础。
