标题：利用乳头瘤病毒样颗粒（PVLPs）实现皮肤基因治疗的突破性进展

《Molecular Therapy Nucleic Acids》：Papillomavirus-like particles as vectors for ex vivo gene therapy of the skin

摘要：本研究探索了乳头瘤病毒样颗粒（PVLPs）在体外皮肤基因治疗中的应用潜力，成功利用PVLPs递送SaCas9和shRNA，有效破坏或降低Olmsted综合征相关基因Trpv3的表达，为遗传性皮肤疾病治疗提供了新策略。

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研究背景

Olmsted综合征是一种由Trpv3基因（编码一种非选择性阳离子通道）功能获得性突变引起的罕见遗传性皮肤疾病。该突变导致TRPV3通道过度活跃，细胞内钙离子水平升高，进而引发角质形成细胞增殖异常、成熟缺陷、免疫细胞浸润以及慢性瘙痒和疼痛等症状。由于皮肤是人体最大的器官，且具有强大的防御机制，使得针对表皮的基因治疗面临诸多挑战。本研究旨在探索一种新型的非整合型病毒载体——乳头瘤病毒样颗粒（PVLPs），用于体外皮肤基因治疗，以克服现有技术的局限性。

研究方法

研究人员首先比较了不同组装方式（细胞组装与无细胞组装）的PVLPs在人类乳头瘤病毒16（HPV16）和小鼠乳头瘤病毒1（MuPV1）衍生的衣壳中的转导效率。实验涉及的细胞类型包括人类细胞系（HEK293细胞）、小鼠角质形成细胞系（KERA-308）以及小鼠原代角质形成细胞。结果显示，在人类HEK293细胞中，HPVLPs的转导效率高于MuPVLPs；而在小鼠KERA-308细胞中，MuPVLPs表现更好。基于MuPVLPs在小鼠细胞中的高效转导能力，研究人员选择其作为后续实验的主要载体。

实验结果

1. PVLPs的转导效率与细胞毒性：在原代角质形成细胞中，PVLPs的转导效率随着时间延长而提高，在10天后，MuPVLPs的转导效率达到66%，优于慢病毒（46%），且细胞毒性较低。这表明PVLPs在分裂细胞中具有较高的转导效率和较低的细胞毒性，适合作为基因编辑工具。
2. SaCas9介导的Trpv3基因破坏：研究人员利用MuPVLPs递送SaCas9和针对Trpv3基因的gRNA，成功在KERA-308细胞和原代角质形成细胞中破坏Trpv3基因。通过基因测序和钙成像实验，发现Trpv3基因破坏后，TRPV3通道的功能显著降低，细胞对TRPV3激动剂的响应减弱，证实了基因破坏的有效性。
3. shRNA介导的Trpv3基因沉默：研究人员还尝试利用PVLPs递送shRNA来沉默Trpv3基因。实验结果表明，特定的shRNA能够显著降低Trpv3 mRNA的表达水平，并减少细胞对TRPV3激动剂的钙离子响应，进一步验证了PVLPs在基因沉默方面的应用潜力。
4. 皮肤等效物的构建与治疗效果评估：研究人员利用PVLPs处理后的原代角质形成细胞构建皮肤等效物，发现几乎所有角质形成细胞都成功转导了PVLPs。在模拟Olmsted综合征的皮肤等效物模型中，MuPVLPs-shRNA处理显著减轻了由Trpv3基因突变引起的角化过度表型，表明PVLPs介导的基因治疗能够部分恢复皮肤的正常功能。

研究结论

本研究成功证明了PVLPs作为一种新型基因治疗载体在体外皮肤基因治疗中的应用潜力。PVLPs能够高效转导角质形成细胞，并通过递送SaCas9或shRNA有效破坏或沉默Trpv3基因，减轻Olmsted综合征的病理特征。此外，PVLPs在构建皮肤等效物方面表现出色，为未来开发针对遗传性皮肤疾病的个性化治疗方案提供了有力支持。未来的研究将进一步探索PVLPs在体内基因治疗中的应用，并优化其长期表达水平和免疫原性，以推动该技术的临床转化。