利用 AAV-DTA 构建新生儿小鼠螺旋神经节神经元退变模型，模拟听神经病新突破

《Molecular Therapy Methods & Clinical Development》：Targeted spiral ganglion neuron degeneration in parvalbumin-Cre neonatal mice

本文利用 AAV-DTA 构建新生儿小鼠模型，实现螺旋神经节神经元（SGNs）选择性退变，模拟听神经病表型。

　　

研究背景

听力损失是一个严重的公共健康问题，在美国有 3000 万人受其影响。感音神经性听力损失（SNHL）的现有治疗手段，如助听器和人工耳蜗，无法恢复自然听力，因此迫切需要开发新的治疗方法来促进毛细胞（HCs）和螺旋神经节神经元（SGNs）的再生与保护。

SGNs 是哺乳动物内耳的初级传入听觉神经元，负责将机械感觉 HCs 与耳蜗核连接起来，传递听觉信号。它分为两种主要亚型，其中 I 型神经元占 SGN 总数的 95%，II 型神经元约占 5%。以往认为 SGN 损失继发于 HC 损伤，但现在发现，噪音、衰老和遗传等多种因素可导致原发性耳蜗神经突触病变和 SGN 损失，而此时 HCs 可能并未受损。这种传入神经损失是听神经病（AN）的潜在病因，AN 患者的听觉脑干阈值缺失，但耳蜗微音器电位和耳声发射正常，约 2%-10% 的听力损失患者患有 AN，听力损失程度从中度到重度不等。由于 SGNs 缺乏内在再生能力，听觉神经损伤或破坏会导致永久性 SNHL，这也会影响人工耳蜗的治疗效果，因此开发 AN 的新型治疗方法至关重要，但目前缺乏能模拟 AN 的动物模型。

此前，研究人员尝试通过耳毒性药物、手术神经切断和压迫等方法建立 AN 模型，但这些方法存在脱靶副作用，结果不稳定，甚至可能致命。也有研究通过基因条件性消融来创建更可靠的模型，如构建转基因小鼠系，但在早期新生儿期使用白喉毒素受体（DTR）小鼠消融 SGNs 的研究尚未见报道。

研究方法

本研究利用病毒介导的 Cre 响应性翻转切除（FLEX）开关系统，表达白喉毒素亚基 A（DTA），构建新生儿小鼠 AN 模型。DTA 可抑制蛋白质合成，通过使真核延伸因子 2 失活导致细胞凋亡，且啮齿动物不表达白喉毒素受体，DTA 能诱导靶细胞凋亡而不影响邻近细胞。FLEX 开关系统在 Cre 重组酶存在时，可使有效载荷易位和反转。研究人员将含有 FLEX-DTA-mCherry 的构建体包装在腺相关病毒（AAV）-retro 血清型中，该血清型在耳蜗中具有神经元趋向性，且不会转染 HCs。构建体由普遍存在的 EF1a 启动子（AAV-eF1a-DTA）或神经元特异性 hSYN 启动子（AAV-hSYN-DTA）驱动，通过后半圆管（PSCC）将其注入 P2 期小白蛋白 - Cre 敲入小鼠（PV^Cre）的耳蜗中，PV^Cre小鼠在新生儿和成年期，其表达小白蛋白的 SGNs 和 HCs 中广泛表达 Cre 重组酶。

研究结果

1. AAV-retro 血清型高效转染 SGNs：将 AAV2-retro-cytomegalovirus（CMV）-GFP 载体注入 P2 小鼠耳蜗，7 天后成像显示，GFP 在整个耳蜗导管的 Rosenthal 管中的 SGN 细胞中大量定位，沿神经纤维也有 GFP 信号，但阳 phalloidin 性的 HCs 未被转导，且在侧壁和血管纹中仅有少量异位 GFP 分布，表明 AAV2-retro 血清型在新生儿耳蜗中对 SGNs 具有高趋向性，且不会转导 HCs。
2. AAV2-retro-FLEX-DTA-mCherry 在 PV^Cre+细胞中表达 DTA：将 FLEX-DTA-mCherry 构建体包装到 AAV2-retro（AAV-DTA）衣壳中，在 P1-P2 期的野生型（WT）小鼠和 PV^Cre小鼠中进行测试。3 天后，WT 小鼠的 SGNs 中观察到 mCherry 蛋白表达，而 PV^Cre小鼠的 SGNs 中未检测到 mCherry 表达，且 SG 细胞数量减少、形态略有变形，说明 AAV-DTA 可在 SGNs 中以 Cre 依赖的方式靶向表达转基因。
3. AAV-DTA 诱导 SGN 凋亡：对 PV^Cre小鼠进行研究，用凋亡标记物切割的 caspase-3 和细胞色素 c 对耳蜗中轴切片进行染色。结果显示，WT 小鼠未观察到切割的 caspase-3 和细胞色素 c 释放，而 PV^Cre小鼠在 3 天和 7 天时，SG 细胞中 caspase-3 激活增加，细胞色素 c 释放，表明 AAV-DTA 诱导的 SGN 消融遵循程序性凋亡事件。
4. AAV-DTA 注射导致 SGN 快速显著退变：将 PV^Cre小鼠与 Ai9 tdTomato Cre 报告小鼠品系杂交，验证 Cre 重组酶在内耳的表达。结果显示，在对照切片中，TUJ1⁺神经元胞体与 tdTomato 信号完全共定位。研究不同启动子对转导 SGNs 和促进细胞死亡的影响，将载体注入新生儿 Td/PV^Cre或对照 Td 小鼠，7 天后量化 SGN 密度。结果表明，AAV-EF1a-DTA 和 AAV-hSYN-DTA 注射的 Td/PV^Cre小鼠平均 SGN 损失分别为 60% 和 61%，且两种启动子在诱导 SGN 细胞死亡的效率上无显著差异，说明 AAV-DTA 诱导 SGN 细胞死亡的效率与启动子无关。
5. AAV-DTA 注射后 SGN 进行性退变：分析 AAV-hSYN-DTA 注射 28 天后的小鼠，与年龄匹配的对照 Td 小鼠相比，发现小鼠年龄对 SGN 损失无显著影响。28 天时，注射左耳的 SGN 几乎完全丧失，未注射的对侧右耳也出现类似的退变模式，且存活的 SGN 形态变小、变形，证明了 AAV-DTA 注射后 SGN 的时间依赖性进行性退变。
6. AAV-DTA 注射后前庭神经节损失：分析 AAV-hSYN-DTA 注射 28 天后左耳的前庭神经节，发现与对照 Td 小鼠相比，AAV-DTA 注射的 Td/PV^Cre小鼠前庭神经节神经元细胞显著损失 85%，但未观察到小鼠出现头倾斜或转圈运动。
7. AAV-DTA 导致严重听力损失，但 HC 功能和形态保持完整：对年龄匹配的未注射 WT 对照小鼠和 AAV-DTA 注射的 Td/PV^Cre小鼠进行听性脑干反应（ABR）和畸变产物耳声发射（DPOAE）测试。结果显示，AAV-DTA 注射的小鼠 ABR 阈值显著升高，而 DPOAE 幅度与对照组无统计学差异，且 HCs 的形态保持完整，表明 AAV-DTA 导致严重听力损失，但不影响 HC 功能，符合 AN 的特征。
8. AAV-DTA 注射导致传入神经纤维退变：评估穿过骨螺旋板（OSL）并支配 HCs 的神经纤维，发现 AAV-DTA 注射 28 天后，Td/PV^Cre小鼠的 tdTomato⁺传入纤维消失，而 TUJ1⁺神经纤维数量减少，形成内螺旋束（ISB）的传入纤维显著变薄，外螺旋束（OSB）几乎完全丧失，且内侧橄榄耳蜗复合体（MOC）的终末仍存在，但 ISB 的大小和 ChAT 表达减少，说明 AAV-DTA 选择性转染并导致传入纤维神经元退变，减少了外侧橄榄耳蜗复合体（LOC）的传出纤维。
9. 成年 Td/PV^Cre小鼠注射 AAV-DTA 不会导致显著 SGN 损伤：对成年 P30 的 Td/PV^Cre小鼠注射 AAV-hSYN-DTA，7 天后收获耳蜗并进行冷冻切片，结果显示与新生小鼠不同，成年小鼠注射 AAV-DTA 后未观察到显著的 SGN 损伤。

研究讨论

本研究成功在新生儿 PV^Cre小鼠中选择性消融 SGNs，注射 AAV-DTA 后 7 天内，SGN 损失约 60%，28 天时小鼠严重失聪，但 HC 组织学和耳声发射保持完整，该模型与 AN 表型一致。与以往利用 DTR 小鼠消融 SGNs 的研究相比，本研究在新生儿小鼠中实现了更高的 SGN 消融效率，且避免了 DTR 方法的一些局限性，如狭窄的药理窗口和潜在的致命副作用。

AAV 血清型和启动子在基因传递中起重要作用。AAV2-retro 是一种工程化 AAV 变体，在新生儿小鼠中可高效转染大多数传入神经元，且对 HCs 的转染极少，与其他血清型相比，具有更高的 SGN 亲和力和更少的异位表达。hSYN 和 EF1a 启动子对 SGNs 具有特异性，本研究比较了这两种启动子，发现它们在诱导 SGN 死亡的效率上无显著差异，表明启动子的强度和细胞特异性不影响 DTA 的消融效率，且两者都是优化基因传递到 SGNs 的有前景的候选者。

FLEX 系统与 AAV 结合，在 Cre 表达小鼠品系中可实现对特定转基因的时空和条件控制。本研究中，AAV-DTA 的转基因表达遵循 Cre-on 模式，且 AAV2-retro 血清型和神经元特异性启动子的高效性降低了脱靶效应，DTA 也不会扩散到邻近细胞，因此该方法对耳蜗相邻组织的脱靶损伤极小。

研究还发现，AAV-DTA 注射后，非注射侧的对侧耳和前庭神经节神经元出现显著损伤，表明病毒扩散到了这些部位。虽然未观察到小鼠出现异常行为变化，但未来仍需进一步研究 AAV-DTA 注射对大脑和其他器官的全身影响。此外，本研究中 AAV-DTA 注射在成熟 PV^Cre小鼠中未导致显著 SGN 退变，可能是因为 AAV2-retro 在成年耳蜗中对 SGNs 的转导效率较低，未来需要对 AAV 设计、新启动子和内耳注射方法进行改进，以提高成年 SGN 的转导效率。

本研究也存在一些局限性。首先，FLEX-DTA-mCherry 质粒依赖 Cre 重组酶，因此动物模型限于神经元 Cre 驱动的品系，开发不依赖特定品系或 Cre 的模型将具有更大的实用性。其次，未进行病毒滴度的剂量依赖性研究，未来研究可探索不同病毒滴度对 SGN 退变程度的影响，以更好地模拟 AN 的广泛表型。

研究意义

本研究利用 AAV-DTA 病毒载体成功介导新生儿小鼠 SGN 退变，模拟了严重的 AN 表型。这种快速、特异性的 SGN 退变模型，有助于加速对 SGN 死亡机制的研究，以及开发潜在的耳保护策略以减轻神经元损失。此外，近乎完全的 SGN 损失模型，为评估再生方法（如表观遗传原位重编程和干细胞移植）在再生或修复外周听觉神经方面的有效性提供了有力平台。