A competition network connects Rab5 and Rab11 GTPases：揭示细胞内膜运输调控新机制

《iScience》：A competition network connects Rab5 and Rab11 GTPases at the surface of endocytic structures

为探究 Rab 蛋白网络调控机制，研究人员研究 Rab5 和 Rab11 GTPases，发现竞争网络可连接二者，影响膜运输。

　　在细胞的微观世界里，膜运输如同一场有条不紊的物流运输，确保细胞内物质的精准传递。而 Rab 小 GTP 酶（Rab small GTPases）则是这场运输的 “调度员”，它们通过与分子效应器的相互作用来调控膜运输的特异性。然而，不同 Rab 蛋白能结合共同效应器这一现象，却对传统的膜运输特异性观点提出了挑战。为了深入了解这一复杂的调控机制，来自意大利多个研究机构（如都灵理工大学、意大利基因组医学研究所等）的研究人员开展了一系列研究，相关成果发表在《iScience》杂志上。

在细胞内膜运输的调控研究中，存在着诸多尚未解决的问题。一方面，Rab 蛋白与效应器的相互作用复杂多样，不同 Rab 蛋白竞争同一效应器的现象使膜运输的调控机制更加扑朔迷离。另一方面，目前对于这种竞争过程在活细胞中的研究手段有限，难以直接探究其亲和力、化学计量和丰度等关键因素。

为了攻克这些难题，研究人员提出了 Rab 竞争网络假说。他们利用粗粒度计算模型，设计并分析了人工 Rab 调控电路，通过相关分析研究不同网络拓扑结构下 Rab GTP 酶的相互作用。同时，采用荧光共振能量转移（FRET）成像技术，对活细胞中 Rab5 和 Rab11 的功能相互作用进行研究。

研究人员主要运用了以下关键技术方法：一是构建计算模型，生成多种竞争和级联模型，模拟 Rab GTP 酶与效应器的相互作用；二是进行细胞转染，将编码荧光标记的 Rab5 和 Rab11 蛋白的质粒转染到细胞中；三是运用时间推移显微镜技术，对细胞内的荧光信号进行实时观察和分析；四是通过相关分析，计算不同信号之间的皮尔逊相关系数，评估 Rab5 和 Rab11 的相互作用。

在研究结果部分，首先是对人工 Rab 相互作用网络的计算机设计。研究人员开发了一个理论框架，探索了两个不同的理论 Rab 模块（RabX、RabY），每个模块包含调节 GTP 酶循环的因子，通过 Rab 效应器调节节点相互连接。通过组合不同的调节回路和功能相互作用模式，生成了 32 种网络架构。

其次，对人工 Rab 相互作用网络进行相关分析。研究发现，在 32 种网络拓扑结构中，16 种在效应器丰度增加时，膜结合的 RabX 和 RabY 之间的相关性更高；部分拓扑结构在 GTP 结合的 RabX 和 RabY 之间的相关性也发生了变化；并且，通过计算 Loop index（IDX），发现不同的自我调节基序与 Loop IDX 的变化相关，如 FFLs 在竞争拓扑结构中显示较低的 Loop IDX 值，而 FBLs 则相反。

接着，利用 FRET 成像和相关分析探测 Rab5 和 Rab11 的功能相互作用。研究人员选择 Rab5 和 Rab11 作为研究对象，通过共表达荧光标记的蛋白和 FRET 生物传感器，监测它们的激活状态和丰度。结果表明，Rab11FIP5/Zfyve26 的表达增加了ρ(Rab5(I) ; Rab11I)，提示它们在调节 Rab5 和 Rab11 在胞吞结构表面的丰度中起作用。同时，通过比较不同条件下的 Loop IDX，推测了不同自我调节基序和网络拓扑结构的功能差异。

然后，验证 Zfyve26 在 Rab5 - Rab11 功能相互作用中的作用。免疫荧光显微镜和 Rab 下拉激活实验表明，Zfyve26 的表达减少了 Rab5 和 Rab11 结构的数量，增加了它们在胞吞表面的含量，并改变了它们的激活状态。此外，过表达 Zfyve26 会导致转铁蛋白回收延迟，暗示了 Zfyve26 对胞吞回收功能的影响。

最后，识别控制 Zfyve26 在胞吞表面水平的分子线索。FRAP 实验和 Zfyve26 下拉结合实验发现，Zfyve26 可以在膜和胞质之间穿梭，其膜招募受 PI (3) P 调控，PI (3) P 的减少会导致 Zfyve26 从膜上分散。同时，研究还利用 Loop Index 探测 Zfyve26 在胞吞表面的饱和度，发现 Loop IDX 与活性 GTP 酶之间的相关性可以反映 Zfyve26 的饱和水平。

在结论和讨论部分，研究人员通过相关分析，确定了分子竞争是确保 Rab 在单个胞吞细胞器表面交叉调节的新设计。Rab 竞争网络通过共享效应器的竞争，形成了更灵活的信号串扰模式，这一模式依赖于组件的浓度和结合亲和力。同时，研究还发现 Zfyve26 作为 Rab5 和 Rab11 的结合蛋白，通过控制 GTP 酶激活状态变化与其丰度之间的关系，在胞吞表面发挥重要作用。此外，研究人员开发的 Loop index 为研究 Rab GTP 酶系统提供了新的视角，有助于进一步理解细胞内膜运输的调控机制。这一研究对于深入了解细胞内膜运输的调控机制具有重要意义，为后续研究相关疾病（如 SPG15 疾病）的发病机制和治疗策略提供了理论基础。