通过 “表型推动” 平台加速细胞适应，缓解急性缺氧应激的化合物研究

《Nature Communications》：A phenopushing platform to identify compounds that alleviate acute hypoxic stress by fast-tracking cellular adaptation

为缓解急性缺氧应激，研究人员开发 “表型推动” 平台，筛选出相关化合物，对细胞保护有重要意义。

　　在生命的舞台上，氧气就像是维持演出顺利进行的关键道具，对多细胞生物来说不可或缺。它在有氧呼吸、新陈代谢和发育等过程中扮演着至关重要的角色。然而，当 “缺氧（Hypoxia）” 这个不速之客出现时，麻烦就接踵而至了。缺氧是众多疾病的幕后推手，像缺血性疾病、呼吸系统疾病、贫血以及非酒精性脂肪肝等。目前针对缺氧应激的治疗手段大多只是在处理缺氧带来的后果，很少能直击要害，解决细胞如何适应低氧环境这个关键问题。

细胞自身其实具备适应缺氧的机制，就好比它们有一套自我保护的 “应急方案”。比如，提前让组织接触缺氧环境，能在一定程度上保护组织免受后续缺血（缺乏氧气和营养物质）带来的伤害。但这个适应过程就像一场缓慢的马拉松，需要耗费不少时间，在这段时间里，细胞可能已经受到了损伤。所以，有没有办法能让细胞加速适应缺氧环境，就像给这场马拉松按下 “加速键” 呢？

来自美国加利福尼亚大学旧金山分校（University of California San Francisco）的研究人员为了解开这个谜题，展开了一项意义重大的研究。他们的研究成果发表在《Nature Communications》上，为缓解急性缺氧应激带来了新的希望。

在这项研究中，研究人员运用了多种关键技术方法。他们通过高内涵显微镜技术，对细胞在缺氧过程中的状态进行了细致观察和分析，构建出细胞对缺氧反应的高维表型空间。利用免疫荧光技术，检测细胞内相关蛋白的表达和磷酸化水平，以此来探究细胞内的信号通路变化。借助 Seahorse 测定法，精确测量细胞的 ATP 生成速率，了解细胞代谢状态的改变。同时，研究人员还对大量细胞系和健康组织进行转录组学分析，筛选出合适的细胞模型用于后续研究。

下面来看看具体的研究结果：

1. 细胞缺氧反应轨迹的表型特征：研究人员精心挑选细胞模型，对比了 1034 种癌细胞系和 53 种健康人体组织后，发现肝癌细胞系 HepG2 与肝脏组织在转录水平上相似度极高，因此选择 HepG2 细胞作为研究对象。接着，他们摸索出合适的实验条件，用不同时长（6 小时到 6 天）的缺氧（1% O?）处理 HepG2 细胞，并挑选了多种基于图像的生物标志物，像用于标记线粒体的 MitoTracker、标记脂质的 BODIPY 493/503 和 C11-BODIPY 581/591，以及用于分割细胞图像的 Hoechst 等。通过这些操作，他们成功总结出 HepG2 细胞对缺氧反应的高维表型特征，绘制出细胞对缺氧的时间响应轨迹。研究发现，1 天的缺氧处理能使细胞处于急性缺氧（AH）状态，此时核 HIF-1α 显著积累；而 6 天的缺氧处理可让细胞达到慢性适应缺氧（CH）状态，对缺血样应激具备耐受性。
2. 筛选推动细胞从急性缺氧向慢性缺氧状态转变的化合物：研究人员精心挑选了 6011 种特征明确的化合物组成筛选文库，这些化合物涵盖了 1928 种蛋白质靶点，几乎涉及所有可成药人类蛋白质的 50% 以及 98%（325 种）的 KEGG 通路。他们用这些化合物预处理 HepG2 细胞 24 小时，随后让细胞暴露于急性缺氧环境 24 小时，总共处理 48 小时。之后，对细胞进行标记、固定和成像分析。通过一系列复杂的计算和筛选，他们确定了 198 种能推动细胞从 AH 状态向 CH 状态转变的 “初级命中化合物”，其中 92 种经过重新测试后确认为 “确认命中化合物”。
3. 确定 mTOR 和 BET 蛋白为推动细胞向 CH 状态转变的潜在靶点：研究人员深入探究发现，在 CH 状态下，mTOR 和 BET 蛋白的活性会下调，而 PI3K 蛋白活性变化不明显。进一步分析发现，大多数命中化合物在 AH 状态下，能加速 mTOR/PI3K/BET 通路活性的下降，使其向 CH 状态下的低水平转变。
4. 命中化合物在缺血细胞模型中拯救 HepG2 细胞存活：虽然命中化合物能让细胞在表型上呈现出 CH 状态的特征，但这是否意味着细胞能获得功能上的保护还不清楚。研究人员对此进行了验证，他们用命中化合物处理细胞，然后让细胞经历缺血样应激（缺氧且缺乏葡萄糖和胎牛血清）。结果发现，约 83%（75/90）的测试命中化合物在至少一个测试剂量下，能显著提高细胞存活率，效果比对照组（DMSO 处理）好很多，其中与 mTOR 和 / 或 PI3K、BET 相关的化合物对细胞存活的促进作用最强。
5. 表型推动化合物保护成熟的诱导多能干细胞衍生心肌细胞（iPSC-CMs）免受缺氧应激：研究人员还想知道这些表型推动化合物在其他细胞环境中是否也能发挥作用。他们选择了成熟的 iPSC-CMs 进行研究，因为这种细胞对缺氧非常敏感，且具有自发规则跳动的特性，便于观察其健康状态。研究人员测试了部分命中化合物，尤其是 mTOR/PI3K 和 BET 抑制剂，发现它们能有效拯救缺氧环境下 iPSC-CMs 的收缩能力，保护其肌节结构完整性。

综合来看，研究人员成功开发了一个早期药物发现平台，通过这个平台，他们精准捕捉到细胞的急性缺氧和慢性缺氧状态，筛选出能推动细胞从急性缺氧向慢性缺氧状态转变的化合物和靶点，并验证了这些化合物在严重缺氧或缺血样条件下对细胞的保护功能。这项研究为药物研发开辟了新的方向，未来可以通过扩大化学文库、改变氧浓度、选择不同细胞类型或时间点等方式，进一步探索更多与缺氧生物学相关的化合物和靶点。同时，研究成果也为深入理解细胞对缺氧的适应机制提供了重要依据，有望为治疗与缺氧相关的疾病带来新的突破。