蛋白质“拼接”技术的重大突破：从低效到超高效的理性设计

《Nature Communications》：A cysteine-less and ultra-fast split intein rationally engineered from being aggregation-prone to highly efficient in protein trans-splicing

在蛋白质工程领域，研究人员长期面临一个难题：许多纯化的分裂内含肽（split inteins）前体表现出部分或无拼接活性。为解决这一问题，德国明斯特大学的研究团队开展了一项针对无半胱氨酸（cysteine-less）且超快速的分裂内含肽的理性设计研究。他们通过对 Aes123 PolB1 分裂内含肽的深入分析，成功将其从易于聚集、拼接效率低的状态改造为高效、稳定的蛋白质转拼接（protein trans-splicing）工具，这一成果为蛋白质修饰应用开辟了新天地，相关研究发表于《Nature Communications》。

　　蛋白质是生命活动的主要承担者，而蛋白质工程的目标之一就是通过人为设计和改造蛋白质，赋予其新的功能或特性。在这一领域，分裂内含肽介导的蛋白质转拼接技术备受关注。分裂内含肽能够催化蛋白质的转拼接，将它们的外显肽（extein）序列连接起来，同时自身发生自我切除。然而，许多纯化的分裂内含肽前体在体外表现出的拼接活性并不理想，这限制了该技术的广泛应用。

德国明斯特大学的研究人员聚焦于 Aes123 PolB1 分裂内含肽，这是一种罕见的无半胱氨酸分裂内含肽，因其对氧化条件的耐受性和与硫醇化学的正交性而具有独特优势。研究团队通过一系列实验发现，该分裂内含肽的 N 端片段存在 β-折叠主导的聚集现象，导致其拼接效率较低（约 30%）。为了克服这一难题，他们运用计算、生化和生物物理分析手段，精准定位了聚集倾向区域，并借助晶体结构信息，设计出稳定的单体突变体，这些突变体几乎完全恢复了拼接活性，同时保留了野生型的超快速反应速率。

研究中，他们首先制备了带有不同外显肽的 AesN 和 AesC 前体蛋白，发现 AesN 前体在溶液中存在两种构象状态：一种是高度聚集的寡聚态，另一种是部分无序的单体态，后者具有几乎完全的拼接活性。进一步的分析揭示了 AesN 片段中 N2 和 N1 两个结构域的聚集倾向，尤其是 N2 结构域。基于这些发现，研究人员利用生物信息学工具预测了可能的聚集核心区域，并通过理性突变策略，成功设计出一系列单体比例增加、拼接效率显著提高的突变体。其中，三重突变体 CLmN（T69K/F75H/M118N）表现最为出色，其拼接效率达到 89%，半衰期仅为 16.3 秒，几乎与野生型相当，且在较宽的浓度范围内保持稳定。

这一成果不仅为蛋白质工程领域提供了一个高效、稳定的无半胱氨酸分裂内含肽工具，还为解决其他分裂内含肽的聚集问题提供了新的思路和方法。通过理性设计，研究人员能够将原本低效的分裂内含肽转变为具有超快速反应和高拼接效率的蛋白质修饰工具，这对于开发新型蛋白质药物、生物传感器以及进行蛋白质功能研究等具有重要意义。

在研究方法方面，研究人员采用了多种关键的技术手段。他们利用尺寸排阻色谱（SEC）分析了 AesN 前体的聚集状态；通过圆二色光谱（CD）和热变性分析研究了 AesN 单体和聚集态的二级结构特征；运用生物信息学工具 AMYLPRED2 预测了聚集倾向区域，并结合晶体结构信息指导突变设计；最后，通过蛋白质转拼接实验验证了突变体的活性和效率。

在研究结果方面，研究人员发现 AesN 前体的聚集现象是导致其拼接效率低下的主要原因。通过理性突变设计，他们成功获得了稳定单体的突变体，这些突变体不仅提高了拼接效率，还保持了野生型的超快速反应特性。例如，三重突变体 CLmN（T69K/F75H/M118N）在与 AesC 前体共孵育时，展现出几乎定量的拼接效率和超快速的反应速率（t_1/2 = 16.3 秒）。此外，该突变体在不同外显肽背景下均表现出良好的活性和稳定性，进一步证明了其作为蛋白质修饰工具的潜力。

在讨论部分，研究人员指出，分裂内含肽的聚集倾向是一个普遍存在的问题，这可能是由于其在进化过程中缺乏足够的压力来抑制聚集。他们推测，分裂内含肽片段在进化过程中可能更倾向于保持其部分无序状态以促进片段间的结合，但这种无序状态也增加了 β-折叠聚集的风险。通过理性设计，研究人员不仅解决了 Aes123 PolB1 分裂内含肽的聚集问题，还为其他分裂内含肽的优化提供了新的策略。这一成果有望推动蛋白质工程领域的发展，为开发新型蛋白质工具和应用提供有力支持。