口服毒素结合蛋白：对抗霍乱腹泻的新希望

霍乱严重威胁公共卫生，现有防控措施存在诸多局限。研究人员开发了一种口服二价 VHH 构建体 BL3.2，能阻断霍乱毒素（CTX）与 GM1 受体的相互作用。在小鼠模型中，它可减轻腹泻、减少肠道液分泌和霍乱弧菌定植，有望防控霍乱。

　　霍乱，这个由霍乱弧菌（Vibrio cholerae）引发的严重肠道传染病，自 1961 年开始的第七次大流行以来，就像一场挥之不去的阴霾，持续威胁着全球公共卫生安全。它通过被污染的水和食物传播，一旦进入人体，霍乱弧菌便会在小肠内大量繁殖，并释放出霍乱毒素（CTX）。CTX 是一种 AB₅毒素，由五个 B 亚基（CTXB）和一个具有酶活性的 A 亚基（CTXA）组成。CTXB 能与人体神经节苷脂受体 GM1 紧密结合，随后 CTXA 进入细胞，刺激环磷酸腺苷（cAMP）的产生，导致氯离子外流，最终引发严重的水样腹泻。不仅如此，CTX 还会促进营养物质释放到小肠腔，为霍乱弧菌的增殖提供 “温床”。

目前，霍乱的防控形势十分严峻。2022 年，霍乱疫情在全球范围内蔓延，波及到更多国家，患病人数也大幅增加。然而，全球用于预防霍乱的资源有限，口服霍乱疫苗（OCVs）供应不足，而且推荐的两剂接种方案也不得不改为一剂。此外，OCVs 还存在诸多问题，比如对五岁以下儿童的效果欠佳，供应链物流也面临挑战，包括疫苗的分发和冷链运输等。因此，开发新的、高效且低成本的霍乱防控措施迫在眉睫。

在此背景下，来自丹麦技术大学、哈佛医学院等机构的研究人员开展了一项极具意义的研究。他们致力于开发一种能够有效对抗霍乱的新方法，最终发现了一种口服可递送的二价 V_HH 构建体 BL3.2，相关研究成果发表在《Nature Communications》上。

研究人员在实验过程中运用了多种关键技术方法。他们通过噬菌体展示筛选，从构建的单域抗体（V_HH）文库中筛选出对 CTXB 有特异性的 V_HH；利用生物层干涉技术（BLI）和表面等离子共振技术（SPR）测定 V_HH 与 CTXB 的结合亲和力；借助氢氘交换质谱（HDX-MS）和尺寸排阻色谱（SEC）分析蛋白间的相互作用；最后，使用 5 日龄 CD-1 小鼠作为动物模型，评估 BL3.2 在体内的效果。

研究结果如下：

• A bivalent V_HH construct abrogates the CTXB–GM1 interaction：研究人员先对两只羊驼进行 CTXB 免疫，构建单域抗体文库，筛选出能阻断 CTXB 与 GM1 相互作用的单域抗体。其中，单域抗体 BL3.1 阻断效果达 88%，亲和力良好。将两个 BL3.1 亚基通过基因融合构建成二价 V_HH 构建体 BL3.2，它在最低摩尔比（1:1）时就能完全阻断 CTXB 与 GM1 的相互作用，效果优于单域抗体。
• BL3.2 is stable under GI passage–relevant conditions：在模拟胃肠道环境的实验中，BL3.2 在模拟胃液（SGF，pH 1.2）中孵育 4 小时，在模拟肠液（SIF，pH 6.8）中孵育 5 小时后，其结合 CTXB 的活性并未降低。同时，通过差示扫描荧光法测定，BL3.2 的热稳定性与 CTX 相当，这表明 BL3.2 在胃肠道环境中具有良好的稳定性。
• BL3.2 inhibits CTX activity in a human cell–based assay：在人结肠腺癌细胞（HCA-7）实验中，BL3.2 能以浓度依赖的方式完全中和 CTX 的活性。当与 CTX 预混合后加入 HCA-7 细胞中，BL3.2 可显著抑制细胞内 cAMP 的产生，其半最大抑制浓度（IC₅₀）为 1.535 nM，对应 V_HH-V_HH:CTX 摩尔比为 13:1。
• BL3.2 binds to the conserved GM1-binding pocket of CTXB：通过 ColabFold 结合经典分子动力学模拟，预测出 BL3.2 与 CTXB 的四个潜在蛋白 - 蛋白界面，其中 Model 4 最为稳定。HDX-MS 和 SEC 分析实验验证了预测结果，确定了 BL3.2 与 CTXB 的结合位点，且关键氨基酸突变会影响其结合能力。
• Orally delivered BL3.2 inhibits CTX activity in vivo：在 5 日龄 CD-1 小鼠体内实验中，口服给予 BL3.2 能有效抑制 CTX 的活性。预先给予 BL3.2 的小鼠，体重减轻明显少于对照组，且未出现腹泻症状，肠道液分泌也显著减少，这表明 BL3.2 在体内能有效中和 CTX 的毒性。
• BL3.2 reduces intestinal colonization levels of V. cholerae：同样在小鼠实验中，给予 BL3.2 的小鼠在感染霍乱弧菌后，体重减轻和肠道液积累明显低于对照组，而且从小肠匀浆中回收的霍乱弧菌 CFU 数量比对照组少约 10 倍，说明 BL3.2 可降低霍乱弧菌在肠道的定植水平。

研究结论和讨论部分指出，BL3.2 这种口服二价 V_HH 构建体具有重要的潜在应用价值。它能够阻断 CTX 与 GM1 受体的相互作用，减轻霍乱弧菌感染引起的腹泻、肠道液分泌和病原体在小肠的定植。与其他抗霍乱策略相比，V_HH 构建体具有独特的优势，如在胃肠道条件下稳定性好、生产效率高且成本低等。此外，BL3.2 作用的靶点在霍乱弧菌的进化过程中高度保守，降低了细菌产生耐药性的风险。不过，目前的动物实验样本量相对较小，未来还需要进一步研究确定其在人体中的有效性和安全性，以及评估生产成本和适宜的给药方案。但总体而言，这项研究为霍乱的防控提供了新的思路和潜在的解决方案，有望在未来的霍乱控制项目中发挥重要作用，为全球公共卫生事业带来新的希望。