探究真菌与人类拓扑异构酶 II 结构差异，助力抗真菌药物设计

《Scientific Reports》：Structural insights into fungal and human topoisomerase II with implications for in silico antifungal drug design

为探究真菌拓扑异构酶 II 能否作为抗真菌药物靶点，研究人员对比分析其与人类拓扑异构酶 IIα 结构，发现差异可用于设计药物。

　　在微观的细胞世界里，有一种神奇的酶 —— 拓扑异构酶（Topoisomerases，简称 topos），它如同一位技艺高超的 “DNA 整理大师”，时刻忙碌地调控着 DNA 的超级螺旋状态，帮助染色体解开复杂的缠绕，对维持基因组的完整性和正常功能起着关键作用。在抗癌和抗菌化疗领域，拓扑异构酶抑制剂早已是 “明星选手”，像依托泊苷、阿霉素等药物，通过抑制拓扑异构酶，有效地阻止癌细胞和细菌的生长繁殖。然而，在抗真菌药物的研发赛道上，拓扑异构酶抑制剂却一直处于 “默默无闻” 的状态，它在抗真菌方面的潜力还远未被挖掘，甚至其作为抗真菌药物靶点的可行性都有待证实。

正是在这样的背景下，来自波兰格但斯克工业大学（Gdansk University of Technology）的研究人员踏上了探索之旅，试图解开真菌拓扑异构酶 II 的神秘面纱，看看它能否成为抗真菌药物研发的新希望。他们的研究成果发表在《Scientific Reports》上，为抗真菌药物的设计开辟了新的思路。

研究人员为了深入探究真菌拓扑异构酶 II 作为抗真菌药物靶点的可能性，开展了一系列严谨且深入的研究。在研究过程中，主要运用了以下几种关键技术方法：

• 序列分析：研究人员收集了多种真菌菌株（如白色念珠菌、光滑念珠菌、酿酒酵母）以及人类拓扑异构酶 II 的蛋白序列，还纳入了进化古老生物的相关序列。利用 Clustal Omega 工具在 Jalview 软件中进行多序列比对，从而分析不同序列间的差异。
• 构建模型与模拟：基于已有的 X 射线晶体结构（如酿酒酵母拓扑异构酶 II 的 PDB：4GFH，人类拓扑异构酶 IIα 的 PDB ID 6ZY7 和 6ZY8），研究人员运用 Modeller 软件和 charmm - gui builder 等工具，对蛋白结构进行完善和调整，构建了用于分子动力学模拟的系统。使用 GROMACS 2020 软件进行经典全原子分子动力学模拟，采用 CHARMM36m 力场和 TIP3P 模型，模拟在特定条件下蛋白的动态行为。
• 结构预测与分析：借助 ColabFold v1.5.5 版本软件（整合 AlphaFold2 和 RoseTTAFold）对不同生物的拓扑异构酶 II 结构进行重建。利用 DoGSiteScorer 在线网络服务器和 MOE 软件的活性位点查找子程序，分析潜在的配体结合位点和配体可及性。

下面来看看具体的研究结果：

• TDL 结构域的比较分析：研究人员重点关注了包含 K 环（K - loop）、螺旋样区域（Helix like region，HLR）和螺旋支撑环区域（Helix Supported Loop Region，HSLR）的转导子和转导子连接子（TDL）结构域。序列比对结果显示，酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）和人类拓扑异构酶 II 的 TDL 区域存在显著差异，序列一致性仅为 42.9%，还存在 7.4% 的序列缺口。
• 分子动力学模拟揭示的结构差异：通过分子动力学模拟，研究人员发现人类拓扑异构酶 IIα 的 α - 螺旋（H1 和 H2）在整个模拟过程中保持稳定，而酿酒酵母拓扑异构酶 II 的 HLR 则呈现出更动态的特性，没有形成稳定的二级结构。在酿酒酵母拓扑异构酶 II 中，K 环与 HLR 之间存在强烈的氢键和静电相互作用，这不仅干扰了 HLR 形成完美螺旋，还影响了蛋白的结构排列。而人类拓扑异构酶 IIα 的 K 环与螺旋之间主要是范德华力 / 库仑力相互作用，且螺旋部分带正电的氨基酸与 K 环相互排斥，有助于维持 α - 螺旋的稳定。在与 DNA 的相互作用方面，人类拓扑异构酶 IIα 的 K 环最初与 DNA 无相互作用，随着模拟进行，一条链的 K 环才与 DNA 相互作用；而酿酒酵母拓扑异构酶 II 的两条链的 K 环能对称地与核酸碱基相互作用。此外，酿酒酵母拓扑异构酶 II 的 HSLR 比人类的更长，且酿酒酵母拓扑异构酶 II 的 HSLR 与同链的 HLR 相互作用，还能与 DNA 的大沟以及蛋白序列中的其他部分相互作用，而人类拓扑异构酶 II 的 HSLR 较短，无法像酿酒酵母那样与 DNA 相互作用。
• 进化分析揭示的差异：对不同生物的拓扑异构酶 II 进行进化分析，结果表明，真菌（如酿酒酵母、白色念珠菌、光滑念珠菌）的拓扑异构酶 II 在 HLR 区域的行为与非真菌生物存在明显差异。在分子动力学模拟中，真菌拓扑异构酶 II 的 HLR 区域监测到的平均氢键长度在 0.4nm 以上，而人类拓扑异构酶 IIα 以及其他一些生物（如 Capsapora owczarzaki、Rozella allomycis、Balamuthia mandrillaris）的该区域平均氢键长度则在 0.35nm 左右波动。在 HSLR 区域，酵母和真菌与其他生物（包括人类）也有很大不同。
• 潜在的抑制剂结合热点：研究人员在酿酒酵母拓扑异构酶 II 的转导子连接子区域发现了几个潜在的抑制剂结合热点。在 K 环和 HLR 之间形成了一个裂缝，该区域电荷分布不对称；HLR 的链间区域也可能是一个潜在的结合位点；此外，在螺旋支撑区域和螺旋区域之间也存在一个热点，并且观察到 399R 和 275D 之间形成了盐桥。通过 DoGSiteScorer 和 MOE 软件分析发现，酿酒酵母拓扑异构酶 II 有两个独特的热点，药物评分超过 0.6，而人类拓扑异构酶 IIα 主要的潜在靶点是 DNA 结合位点和 ATP 酶位点。

综合以上研究结果，研究人员得出结论：真菌和人类拓扑异构酶 II 的 TDL 结构域在结构和功能属性上存在显著差异。这些差异源于进化过程中的序列变化，使得真菌拓扑异构酶 II 的 TDL 结构域具有独特的结构。研究中发现的结构差异，如 K 环、α - 螺旋（或螺旋样区域）和螺旋支撑环区域的不同，以及酿酒酵母拓扑异构酶 II 中独特的亲水和疏水分子内相互作用模式，为抗真菌药物的设计提供了潜在的药效基团区域（热点）。特别是真菌拓扑异构酶 II 中 HLR 区域不是像人类那样的刚性螺旋结构，以及其独特的能与 DNA 相互作用的螺旋支撑环区域，都有望成为设计选择性抑制真菌拓扑异构酶 II 的药物的重要靶点。这一研究成果为抗真菌药物的研发指明了新方向，尽管还需要进一步的实验验证，但已经为后续研究奠定了坚实的基础，开启了利用真菌和人类拓扑异构酶 II 结构差异开发新型抗真菌药物的大门。