利用超大合成大环肽库发现高效配体，助力肽类药物研发

《SCIENCE ADVANCES》：Affinity selection–mass spectrometry with linearizable macrocyclic peptide libraries

为解决大环肽库应用受限问题，研究人员开展相关研究，发现纳米摩尔级配体，推动肽类药物发展。

　　

探索大环肽库：解锁药物研发新密码

在生命科学和医学研究的广阔领域中，蛋白质 - 蛋白质相互作用（Protein - Protein Interactions）如同精密的齿轮，驱动着细胞的各种生理活动。一旦这些相互作用出现异常，疾病的阴霾便可能笼罩。因此，寻找能够精准调控这些相互作用的 “钥匙”—— 配体，成为了药物研发的关键目标。

大环肽（Macrocyclic Peptides）作为药物研发的潜力新星，备受科研人员关注。它就像一把把量身定制的 “分子钥匙”，相较于小分子，能够更精准地契合蛋白质的 “锁孔”，干扰异常的蛋白质 - 蛋白质相互作用；与蛋白质相比，又具备穿越生物膜的神奇能力，让药物能够更顺利地抵达作用靶点。而且，大环化（Macrocyclization）就像是给大环肽加上了特殊的 “保护盾”，不仅增强了它抵抗蛋白酶降解的能力，还提升了细胞通透性、结合亲和力以及口服生物利用度。

然而，在实际应用中，大环肽库却遭遇了重重阻碍。虽然其在药物研发中潜力巨大，但合成大规模的大环肽库并用于配体发现却困难重重。传统的合成方法制备的大环肽库规模较小，难以满足筛选高亲和力配体的需求。同时，在质谱（Mass Spectrometry，MS）中解码大环肽序列的复杂性，也成为了限制其发展的瓶颈。面对这些挑战，科研人员迫切需要寻找新的解决方案。

来自国外研究机构的研究人员勇敢地迎接挑战，开启了这项意义非凡的研究之旅。他们致力于突破大环肽库应用的限制，为肽类药物研发开辟新的道路。最终，他们的努力取得了丰硕的成果，成功发现了针对特定蛋白质的纳米摩尔级配体，这一突破为肽类药物的发展注入了新的活力，相关研究成果发表在《SCIENCE ADVANCES》上。

技术突破：搭建探索大环肽库的桥梁

在这场探索之旅中，研究人员运用了多种关键技术。首先是拆分 - 混合固相肽合成（split - and - pool solid - phase peptide synthesis）技术，这一技术如同搭建分子大厦的精密工匠，能够高效地合成包含天然和非天然氨基酸的大环肽库。

为了实现大环化，研究人员利用碘在溶液中的快速氧化作用，促使分子内二硫键（Disulfide Bond）近乎定量地形成。这就像是给大环肽库加上了坚固的 “分子纽带”，确保其结构的稳定性。而且，通过 Ellman's 测定和尺寸排阻色谱（Size Exclusion Chromatography，SEC）等技术，研究人员能够精准地验证肽库的完整性，确认二硫键的形成情况。

在解码大环肽序列的难题上，研究人员采用了温和的还原方法，利用 1,3 - 二硫苏糖醇（Dithiothreitol，DTT）在加热条件下将大环肽线性化，使其能够适用于标准的串联质谱（Tandem Mass Spectrometry，MS/MS）测序，成功地攻克了这一关键技术难题。

研究成果：解锁大环肽库的神秘宝藏

高效构建大环肽库

研究人员通过拆分 - 混合固相肽合成技术，以 20 - μm 树脂为基础，成功制备了规模高达 1 亿成员的大环肽库。在这个过程中，他们巧妙地设计了不同的肽库结构，如 CX₁₂CK 和 X₆CX₆CK（其中 X 代表除半胱氨酸和异亮氨酸外的所有标准氨基酸，C代表半胱氨酸、高半胱氨酸和青霉胺），以此来精确控制二硫键的形成。

实验结果令人振奋，碘促进的环化反应展现出了极高的效率。通过 Ellman's 测定发现，反应近乎定量地将肽库中的巯基氧化为二硫键。SEC 分析也证实，形成的二硫键均为分子内的，几乎没有出现分子间的二硫键，从而得到了纯度极高的单体大环肽库。这一成果为后续的配体筛选奠定了坚实的基础。

发现针对不同靶点的高亲和力配体

研究人员将制备好的大环肽库应用于亲和力选择（Affinity Selection）实验，以抗血凝素抗体克隆 12ca5（anti - hemagglutinin antibody clone 12ca5）和小鼠钙粘蛋白 - 2（cadherin - 2，CDH2）为目标靶点。

在针对 12ca5 的研究中，通过亲和力选择 - 质谱（Affinity Selection decoded by Mass Spectrometry，AS - MS）技术，成功从 X₆CX₆CK 肽库中筛选出了 7 个高亲和力的肽配体，从CX₁₂CK 肽库中筛选出 1 个肽配体。这些配体的解离常数（K_d）均处于低纳米摩尔到高皮摩尔的范围，展现出了极强的结合能力。

对于 CDH2，研究人员以其胞外结构域的 4 - 5 结构域融合蛋白为靶点，同样利用 AS - MS 技术进行筛选。令人惊喜的是，他们发现了多个纳米摩尔亲和力的结合物，其中一种名为 cadherin - binding peptide（CBP）的肽表现尤为突出，其 K_d值达到了 53 nM。通过一系列对照实验，如合成乱序序列和线性化形式的 CBP 进行测试，证实了 CBP 的高亲和力和结合特异性，且大环结构的 CBP 相较于线性形式，更有利于与 CDH2 结合。

结构 - 活性关系研究与新配体优化

为了深入了解 CBP 与 CDH2 的结合机制，研究人员开展了结构 - 活性关系（Structure - Activity Relationship，SAR）研究。他们通过丙氨酸扫描（alanine scan）、d - 氨基酸扫描（d-amino acid scan）和 N - 端截断研究等方法，对 CBP 进行了全面的剖析。

研究发现，Lys⁴、Phe⁶、Lys¹²和 Lys¹⁵等残基是 CBP 与 CDH2 结合的关键热点（hotspots），这些残基的突变会导致结合能力的完全丧失；而 Met²、Thr³、Leu⁵、Thr¹⁰和 Asp¹³等残基则为冷点（coldspots），对结合影响较小。

基于这些研究结果，研究人员设计了两个聚焦文库，分别对热点和冷点残基进行修饰。令人意外的是，针对热点残基修饰的文库并未筛选出高亲和力的配体，而对冷点残基进行修饰的文库则成功筛选出了 10 个高亲和力的非经典大环 CDH2 肽结合物（NCBPs）。其中，NCBP - 4表现最为出色，其 K_d值达到了 29 ± 5 nM，且相较于 CBP，在结合亲和力和 BLI 信号强度上都有显著提升。此外，NCBP - 4还展现出了更强的抗蛋白酶水解能力，其在胰凝乳蛋白酶（chymotrypsin）作用下的半衰期比 CBP 延长了约 40 倍，这为开发更稳定的肽类药物提供了重要的参考。

研究意义：照亮肽类药物研发的新征程

这项研究成功建立了一套高效的高多样性大环肽库合成和应用方法，为解决大环肽库在药物研发中的应用难题提供了创新的解决方案。研究人员通过实验证明了超大合成大环肽库在配体发现中的巨大潜力，成功筛选出了针对不同蛋白质靶点的高亲和力配体，这对于理解蛋白质 - 蛋白质相互作用机制以及开发新型肽类药物具有重要的指导意义。

在研究过程中，对 CBP 进行的结构 - 活性关系研究，深入揭示了影响配体结合亲和力的关键因素，为后续的肽类药物设计和优化提供了宝贵的理论依据。同时，通过对冷点残基的修饰成功筛选出高亲和力配体的策略，也为肽类药物的开发开辟了新的思路，让科研人员认识到在药物研发中，不仅要关注关键的活性位点，那些看似非关键的位点也可能蕴含着提升药物性能的巨大潜力。

总的来说，这项研究成果为肽类药物的研发注入了新的活力，有望推动肽类药物从实验室走向临床应用的进程，为人类健康事业带来新的希望。