基于数字病理学的DLBCL淋巴瘤微环境分类及免疫治疗新靶点研究

《Cell Reports Medicine》：Practical microenvironment classification in diffuse large B cell lymphoma using digital pathology

本研究通过数字病理学方法建立了弥漫大B细胞淋巴瘤（DLBCL）的淋巴瘤微环境（LME）分类，揭示了不同亚型的免疫逃逸机制及免疫治疗靶点，为DLBCL精准治疗提供了新思路。

　　弥漫大B细胞淋巴瘤（DLBCL）是一种异质性较强的B细胞恶性肿瘤，其临床预后受到肿瘤细胞来源以及淋巴瘤微环境（LME）改变的双重影响。近年来，基于转录组学的研究将DLBCL划分为四种亚型，即生发中心（GC）样、间充质（MS）、炎症（IN）和耗竭（DP）亚型，但将这种分类体系应用于临床实践仍面临诸多挑战。本研究巧妙地利用数字病理学技术，通过免疫组化标记物（包括CD3、CD8、CD68、PD-L1和胶原蛋白）对DLBCL的LME进行分类，成功开发出一种与转录组学分类具有超过80%一致性的染色算法。单细胞测序结果进一步证实，该算法所区分的免疫微环境与转录组学特征高度吻合。在标准的利妥昔单抗、环磷酰胺、阿霉素、长春新碱和泼尼松（R-CHOP）方案或R-CHOP联合靶向药物（R-CHOP-X）免疫化疗后，不同LME亚型的患者在总生存期（OS）和无进展生存期（PFS）上存在显著差异。此外，各LME亚型还表现出不同的免疫逃逸机制，为未来的免疫治疗提供了特定的靶点，有力地支持了将这种分类应用于未来的精准医学试验。

研究背景方面，DLBCL作为侵袭性淋巴瘤中最常见的亚型，其发病率在全球范围内呈快速上升趋势。尽管以抗CD20单克隆抗体联合化疗作为一线治疗方案取得了显著的临床改善，但在高危DLBCL患者中，治愈率仍有待进一步提高。基于基因表达谱，DLBCL最初根据B细胞发育阶段被划分为生发中心B细胞（GCBs）、活化B细胞（ABCs）和未分类三种亚型。随后，研究者们又在细胞起源（COO）分类的基础上进一步描绘了基于肿瘤细胞遗传学改变的遗传亚型。然而，DLBCL的异质性还可能源自肿瘤细胞与淋巴瘤微环境（LME）组分之间的相互作用。大规模转录组学数据的应用使得研究者能够识别出DLBCL的四种不同LME亚型，这些亚型与COO或遗传亚型并不重叠，但在治疗反应和预后方面表现出显著差异，凸显了其作为DLBCL异质性重要贡献者的地位。

在研究方法上，研究团队首先应用Kotlov等人开发的分类器对包含682例新诊断DLBCL患者的转录组队列进行LME分类，结果显示各亚型的分布比例分别为：GC亚型13.0%、MS亚型34.5%、IN亚型24.8%和DP亚型27.7%。通过单样本基因集富集分析（ssGSEA）评分和去卷积方法，研究者们量化了各LME亚型的细胞和分子组分。在临床特征方面，IN亚型与中高危国际预后指数（IPI）（p=0.009）、晚期Ann Arbor分期（p=0.021）和血清乳酸脱氢酶（LDH）升高（p=0.001）显著相关。DP亚型则与较差的体能状态（p=0.025）以及双打击/三打击淋巴瘤（p=0.004）和双表达淋巴瘤（p=0.066）的高比例显著相关。此外，LME亚型与COO分类之间也存在一定的相关性，IN亚型在基于基因表达谱的COO（GEP-based COO）和基于Hans算法的COO（HANS-based COO）分类中均与GCB亚型显著负相关。

在细胞组分分析中，研究者们利用主流的去卷积方法量化了各LME亚型的细胞组分。GC亚型富含CD4?T细胞，包括滤泡辅助T细胞（Tfh）和调节性T细胞（Treg）；MS亚型富含内皮细胞（ECs）、癌症相关成纤维细胞（CAFs）和中性粒细胞；IN亚型则高度浸润CD8?T细胞、自然杀伤（NK）细胞、巨噬细胞和浆细胞样树突状细胞，而DP亚型则相对缺乏所有免疫和基质细胞。在治疗反应和预后方面，接受一线标准免疫化疗（R-CHOP）的患者中，IN和DP亚型的PFS（p<0.001）和OS（p=0.005）显著低于GC和MS亚型。此外，IN和DP亚型的治疗失败风险更高，表现为较低的完全缓解率（p=0.002）和客观缓解率（p<0.001）。然而，在接受一线R-CHOP-X免疫化疗的患者中，四种亚型之间并未观察到PFS和OS的差异。

在病理和分子特征方面，研究团队此前开发了一种名为LymphPlex的简化算法，用于基于35个基因的突变和三个基因（BCL2、BCL6和MYC）的重排对DLBCL遗传亚型进行分类。结果显示，LME亚型与LymphPlex遗传亚型并不重叠，表明它们在描述肿瘤异质性方面具有独立性。此外，与淋巴瘤发生相关的几条主要致癌通路在不同LME亚型中表现出不同的表达模式。GC亚型以NOTCH信号通路激活和细胞静止为特征；MS亚型以WNT信号通路占优势；IN亚型表现出细胞静止，同时核因子κB（NF-κB）、JAK和丝裂原活化蛋白激酶信号通路显著富集；而DP亚型则表现出MYC原癌基因（MYC）、B细胞受体（BCR）和磷脂酰肌醇3激酶信号通路的过度激活，并伴有增殖相关基因特征。

为了通过病理染色和全切片图像分析重现LME，研究者们排除了缺乏显著微环境组分的DP亚型，并根据各非DP亚型的微环境组分差异选择了候选染色标记物。通过去卷积方法评估微环境组分的丰度，并利用曲线下面积（AUC）对区分特定亚型与非DP亚型的代表性微环境组分和候选染色标记物进行排名。GC亚型以T细胞和CD4?T细胞为特征，标记为CD3和CD4；MS亚型与CAFs和ECs相关，分别标记为纤维细胞激活蛋白（FAP）和胶原蛋白，以及用于ECs的CD34；IN亚型以CD8?T细胞和巨噬细胞为特征，分别标记为CD8和CD68。此外，由于PD-L1主要在DLBCL的巨噬细胞上表达，也被纳入其中。随后，研究者们进一步检查了所选标记物基因表达水平与其对应免疫细胞丰度之间的相关性。CD3与T细胞（R2=0.72，p<0.001）呈强相关，CD4与CD4?T细胞（R2=0.16，p<0.001）也存在相关性。同样，CD34与ECs（R2=0.54，p<0.001）呈显著相关性。COL3A1（R2=0.86，p<0.001）和FAP（R2=0.49，p<0.001）与CAFs的相关性也得到了证实。CD8与CD8?中央记忆T细胞（CD8?Tcm）（R2=0.69，p<0.001）呈相关性，而CD68（R2=0.33，p<0.001）和PD-L1（R2=0.26，p<0.001）与巨噬细胞M1呈相关性。这些相关性突出了不同LME亚型之间的显著差异。在完成标记物选择后，CD3、CD4、CD8、CD68、PD-L1、FAP和CD34被纳入免疫组化染色，胶原纤维则采用Mallory三色染