3D 染色质架构在乳腺癌内分泌耐药中的关键作用及潜在治疗新途径

《Cell Reports》：Hi-C profiling in tissues reveals 3D chromatin-regulated breast tumor heterogeneity informing a looping-mediated therapeutic avenue

本文通过对 12 例乳腺组织进行 Hi-C 分析，揭示 3D 染色质调控的肿瘤异质性，发现 CA2 在耐药中的作用及治疗潜力。

　　### 研究背景
内分泌治疗如他莫昔芬（Tamoxifen，Tam）是雌激素受体 -α 阳性（ER+）乳腺癌患者的标准治疗方案，但约三分之一的患者会产生治疗耐药，目前治疗策略未充分考虑患者肿瘤基因组异质性。对乳腺癌患者队列基因组研究揭示了个体肿瘤分子差异，但多聚焦于拷贝数和基因表达分析。

当前对 3D 染色质调控的认知多源于体外细胞培养 Hi-C 分析，虽有助于理解疾病中 3D 调控生物通路变化，但存在局限性，如无法重现疾病特异性生理特性和缺乏临床相关微环境。部分研究将 Hi-C 技术应用于人类患者样本，揭示了患者或肿瘤亚型特异性 3D 基因组架构，但乳腺癌患者 3D 染色质景观研究仍匮乏。

研究方法

本研究对 12 例乳腺组织（2 例正常组织、5 例 ER + 原发性肿瘤、5 例 Tam 治疗后复发性肿瘤）进行组织特异性 Hi-C 分析，产生约 40 亿条原始双端读数。运用 HiC-Pro、dcHiC、TopDom、FitHiC2 等多种工具分析染色质架构的不同层面，包括 A/B 隔室、拓扑关联结构域（TAD）和染色质环。开发计算算法 Group- and Individual-Sample-Specific TADs（GISTA）识别肿瘤特异性 TADs 变化。通过交叉检查肿瘤和细胞系来源的差异表达环化基因（Differentially Expressed Looping Genes，DELGs），结合基因本体（Gene Ontology，GO）和生物学通路分析，确定潜在的耐药相关生物学通路。利用细胞系和细胞系来源的异种移植（Cell-Line-Derived Xenografts，CDX）小鼠模型，测试靶向代谢通路抑制剂的效果，并通过染色体构象捕获（3C）/ 实时定量 PCR（qPCR）验证。运用 CRISPR-Cas9 技术删除 CA2 增强子环化区域，评估其在介导内分泌耐药中的因果关系。

研究结果

1. 隔室在乳腺肿瘤中基本保持不变：12 例组织中 A/B 隔室数量大致相同（约 2000 个），且大小多数小于 2Mb。肿瘤组织间隔室模式保守，但肿瘤组织与正常组织间存在较大差异。在肿瘤进展过程中，部分染色质区域发生隔室翻转，如从 B 到 A 的翻转在原发性肿瘤（PT）到复发性肿瘤（RT）的转变中更为显著。通过计算隔室相似性发现，组织内相关性高于组织间相关性，RT-PT 相关性高于 PT - 正常组织（NT）和 RT-NT 相关性。
2. TADs 在乳腺肿瘤中高度异质：使用 TopDom 在 12 例组织中识别出约 6000 个 TADs，其大小分布相似。GISTA 分析定义了肿瘤间保守 TADs（C-TADs）、中度可变 TADs（MV-TADs）和显著可变 TADs（SV-TADs），以及个体肿瘤特异性 TADs（IT-specific TADs）的不同类型。研究发现，SV-TADs 的 TAD 阵列大小大于 MV-TADs 和 C-TADs，且 HS 类型多于 LS 类型，混合类型在 TAD 变化中占比超过 50%。
3. 染色质环在乳腺肿瘤中变化剧烈：FitHiC2 识别出每个组织约 100,000 - 140,000 个相互作用位点和平均约 25,000 个启动子 - 远端（P-D）环，平均每个组织有约 12,000 个环化基因。通过计算基因环化强度（LI）和双高斯建模，确定个体肿瘤特异性差异环化基因（DLGs），包括获得性（GLGs）和缺失性（LLGs）环化基因。发现环化基因在个体肿瘤间差异显著，共享 GLGs 或 LLGs 的数量随共享肿瘤数量增加而减少。
4. 交叉检查确定 RT 特异性环化介导的生物学通路：比较 RT 特异性 DLGs、差异隔室和 SV-TADs，发现环化基因与 TAD 变化的关联多于与差异隔室的关联，且 HS TADs 与 DLGs 呈正相关。分析染色质架构与拷贝数变异（CNVs）的关系，发现肿瘤组织中隔室与拷贝数增减的重叠比例更高，CNV 断点周围 TAD 边界接触频率低，RTs 中位于拷贝数增减区域的环总数多于 PTs。交叉检查肿瘤和细胞系来源的 DLGs，确定了多个可能参与调节 Tam 耐药的信号通路，如 RNA 稳定、碳酸氢盐运输和氮代谢等。其中，CA2 基因高表达与乳腺癌患者接受 Tam 治疗后的无复发生存率差相关，且在 RTs 中表达更高，其远端环存在多种转录因子和组蛋白标记的富集。
5. 抑制 CA2 可抑制肿瘤生长：已有研究表明 CA2 在肿瘤进展、转移和治疗耐药中起重要作用，本研究进一步表明其可能是驱动 Tam 耐药的关键基因。使用布林佐胺（brinzolamide）抑制 CA2，在体外实验中，对 Tam 耐药细胞系（MCF7/MCF7TR 和 T47D/T47DTR）的生长抑制作用强于 Tam 敏感细胞系；在体内 CDX 小鼠模型中，显著抑制 MCF7TR 肿瘤生长，且未观察到药物诱导的毒性。
6. 抑制 CA2 可逆转染色质环化：3C-qPCR 和实时 qPCR 分析显示，布林佐胺处理后，MCF7TR 和 T47DTR 细胞中 CA2 的增强子 - 启动子环化（EPL）相互作用显著降低，其他环化基因的 EPL 相互作用也减弱。同时，CA2 基因表达水平在耐药细胞系中发生逆转。CRISPR-Cas9 技术删除 CA2 增强子环化区域后，MCF7TR 细胞生长显著降低，CA2 转录水平和蛋白表达减少，表明 CA2 EPL 在调控乳腺癌 Tam 耐药中起关键作用。

研究讨论

本研究首次对乳腺肿瘤组织 3D 染色质变异性进行研究，揭示了肿瘤间在隔室、TAD 和染色质环层面的异质性。确定了 CA2 在驱动 Tam 耐药中的潜在作用，为乳腺癌内分泌耐药治疗提供了新的靶点和治疗思路。然而，研究存在局限性，如 Hi-C 数据测序深度不足，可能影响近端环的检测；样本量较小，限制了研究结果的普遍性，且存在年龄相关混杂因素。未来研究需扩大样本量、进行更深层次测序，以进一步验证研究结果，深入探究 3D 染色质架构在乳腺癌内分泌耐药中的作用机制，为临床治疗提供更有效的策略。