靶向 AGO2 增强癌症免疫治疗效果的新突破

《Cell Reports》：AGO2 mediates immunotherapy failure via suppressing tumor IFN-gamma response-dependent CD8+ T cell immunity

研究发现 AGO2 抑制肿瘤细胞对 IFN-γ 应答，靶向 AGO2 可提升免疫治疗疗效。

　　### 研究背景
免疫检查点抑制剂（ICIs）在癌症治疗中取得了显著进展，但多数患者无法从这些治疗中获得持久的临床益处。广泛的研究揭示了多种导致免疫治疗耐药的机制，其中干扰素 -γ（IFN-γ）信号通路功能障碍尤为关键。IFN-γ 是由活化淋巴细胞产生的多功能细胞因子，在协调有效的抗肿瘤免疫反应中发挥着不可或缺的作用。正常情况下，IFN-γ 与肿瘤细胞结合会引发信号转导和转录激活因子 1（STAT1）磷酸化，进而调节 C-X-C 基序趋化因子配体（CXCLs）、IFN 刺激基因（ISGs）和人类白细胞抗原（HLA）家族基因的表达，增强肿瘤抗原呈递，促进 CD8⁺T 细胞的浸润和细胞毒性。然而，肿瘤细胞能够通过多种机制逃避 IFN-γ 介导的免疫激活，导致免疫治疗失败。

Argonaute 2（AGO2）是 Argonaute 家族的关键成员，作为微小 RNA（miRNA）传感器，可对 miRNA 库的动态变化迅速做出反应，并靶向下游 mRNA 发挥多种作用。AGO2 在肿瘤免疫治疗中的作用存在争议，其具体效应取决于不同刺激下 miRNA 库的组成。

AGO2 过表达与 CD8⁺T 细胞免疫抑制和免疫治疗失败相关

研究人员通过 CRISPR - Cas9 技术构建了 Ago2 基因敲除（KO）的小鼠膀胱癌（MB49）细胞，并将其接种到 C57BL/6 小鼠膀胱中建立原位肿瘤模型，同时构建了皮下 MB49 模型。结果显示，敲除 Ago2 基因显著减小了肿瘤体积。对肿瘤组织进行 mRNA 测序和基因集富集分析（GSEA）发现，Ago2 基因敲除组中与效应 T 细胞（Teff）激活、T 细胞浸润和 T 细胞细胞毒性相关的关键基因集显著上调。

进一步研究发现，在免疫缺陷的 BALB/c - Nu/Nu 小鼠中，Ago2 基因缺失对肿瘤生长无影响，且体外集落形成实验也证实了这一点。通过腹腔注射 CD8a 中和抗体耗尽小鼠体内的 CD8⁺T 细胞后，Ago2 基因敲除导致的肿瘤缩小效应几乎消失。流式细胞术分析表明，肿瘤中 Ago2 基因敲除显著增加了 CD8⁺T 细胞的浸润和功能，表现为 IFN-γ 和肿瘤坏死因子 α（TNF-α）产生增强。

在人膀胱癌研究中，研究人员在 UMUC - 3 细胞系中过表达 FLAG 标记的 NY - ESO - 1，构建了 T 细胞受体（TCR）-CD8⁺T 细胞识别的特异性系统。在裸鼠过继转移模型中，注射人外周血来源的活化 TCR - CD8⁺T 细胞后，AGO2 基因敲除的细胞肿瘤体积明显减小。体外实验也验证了 AGO2 基因敲除可增强 CD8⁺T 细胞介导的杀伤作用。

此外，对接受抗 PD - 1 免疫治疗的膀胱癌患者队列分析发现，AGO2 蛋白水平与 CD8⁺T 细胞浸润、免疫治疗反应和患者生存率呈负相关。在另外两个独立的免疫治疗数据集中也验证了这一结果，同时对已发表的尿路上皮癌和黑色素瘤免疫治疗测序数据的分析表明，AGO2 高表达的患者免疫治疗后生存率并未延长。

AGO2 通过抑制 STAT1 激活抑制肿瘤 IFN-γ 应答依赖性 CD8⁺T 细胞免疫

重新分析小鼠体内 RNA 测序数据发现，肿瘤细胞中 Ago2 基因敲除除了影响 T 细胞相关通路外，还显著增强了抗原呈递、IFN-γ 应答和免疫反应相关信号。由于 IFN-γ 应答信号通路（IFNG - STAT1 - CXCLs/HLAs）对肿瘤抗原呈递以及随后 CD8⁺T 细胞的浸润和细胞毒性至关重要，研究人员推测 AGO2 可能通过抑制该通路来抑制 CD8⁺T 细胞免疫。

在 UMUC - 3 和自建的患者来源的膀胱癌细胞系 SYBC1 中研究发现，IFN-γ 处理后，AGO2 基因敲除细胞中 STAT1 的激活（pSTAT1）显著上调，而 AGO2 本身未发生变化。相应地，STAT1 的下游效应分子，如 CXCL9、ISG15 和 HLAs 也上调。免疫荧光实验证实 AGO2 基因敲除后 STAT1 的核转位显著增加。此外，在 AGO2 基因敲除细胞中恢复 AGO2 表达后，pSTAT1 水平逆转。

在体内实验中，构建 Ago2 和 Stat1 双基因敲除的 MB49 细胞，结果显示肿瘤体积显著增加，且 Ago2 基因敲除介导的 CD8⁺T 细胞浸润和细胞毒性增强作用在进一步敲除 Stat1 后减弱。这些结果表明 AGO2 以 IFN-γ - STAT1 依赖的方式削弱 CD8⁺T 细胞免疫。

AGO2 通过维持 PTPN6 的 mRNA 稳定性抑制 STAT1 激活

先前研究已确定了多个 STAT1 激活及其下游信号的关键调节因子，包括 PTPN 家族（如 PTPN6 和 PTPN11）、细胞因子信号抑制因子（SOCS）家族（包括 SOCS1、SOCS2 和 SOCS3）、激活 STAT 蛋白抑制剂（PIAS）家族（如 PIAS1、PIAS3 和 PIAS4）、Janus 激酶 1（JAK1）和 DEAD 盒螺旋酶 3 X 连锁（DDX3X）。研究人员分析体内 RNA 测序数据发现，Ago2 基因敲除肿瘤中 Ptpn6 mRNA 显著下调，而 Socs1 表达显著上调。在人 AGO2 基因敲除的膀胱癌细胞中经 IFN-γ 刺激后验证发现，SOCS1 表达未发生变化，而 PTPN6 表达在 IFN-γ 刺激下显著增加，且这种增加在 AGO2 基因敲除细胞中受到抑制。重要的是，在无 IFN-γ 刺激时，AGO2 基因敲除不影响 PTPN6 表达，表明 AGO2 对 PTPN6 的调节依赖于 IFN-γ 刺激。

进一步研究发现，IFN-γ 刺激下，AGO2 基因敲除细胞中 PTPN6 蛋白水平显著降低，而 STAT1 激活增强。使用 AGO2 抑制剂 BCI - 137 也得到了类似结果，且呈浓度依赖性。将 AGO2 重新引入 PTPN6 基因敲除细胞中发现，AGO2 过表达不再抑制 STAT1 激活。在体内实验中，Ago2 过表达导致肿瘤体积增大，CD8⁺T 细胞浸润减少，而在 Ptpn6 基因敲除细胞中这种效应被逆转。

研究人员还探究了 AGO2 调节 PTPN6 表达的机制，通过放线菌素 D 追踪实验、RNA 免疫沉淀（RIP）实验和 RNA 下拉实验发现，IFN-γ 增强了 AGO2 与 PTPN6 mRNA 的结合，稳定了其 mRNA，从而抑制了 STAT1 激活。

AGO2 通过 miR-1246 以 IFN-γ 依赖的方式稳定 PTPN6 的 mRNA

研究人员进一步探究 IFN-γ 如何通过 AGO2 影响 PTPN6 的 mRNA 稳定性。先前研究表明 AGO2 维持 mRNA 稳定性通常需要 miRNA 的参与。通过 RIP - miRNA 测序发现，IFN-γ 处理后，miR - 1246 和 miR - 4485 - 3p 这两种 miRNA 的表达显著上调，且与 AGO2 的结合水平增加。qPCR 实验证实了这两种 miRNA 在正常培养条件下表达较低，IFN-γ 可显著上调其表达，RIP - qPCR 实验也证实 IFN-γ 可显著增强 AGO2 与这两种 miRNA 的结合。

使用针对这两种 miRNA 的抑制剂发现，抑制 miR - 1246 可显著降低 IFN-γ 处理下 PTPN6 的 mRNA 稳定性，而抑制 miR - 4485 - 3p 几乎没有影响。RIP - qPCR 实验还发现，抑制 miR - 1246 显著减弱了 AGO2 与 PTPN6 mRNA 的结合，而抑制 miR - 4485 - 3p 则没有这种效果。过表达 miR - 1246 通过 miRNA 模拟物也得到了一致结果。此外，抑制 miR - 1246 后 STAT1 的激活显著增强，而抑制 miR - 4485 - 3p 则没有显著变化。在 AGO2 基因敲除细胞中，miR - 1246 对 PTPN6 mRNA 的稳定作用消失，进一步证实了这种稳定作用依赖于 AGO2。

研究人员构建了 PTPN6 mRNA 的截短体，通过体外转录和下拉实验揭示 PTPN6 mRNA 的编码区（CDS）特异性结合 miR - 1246 - AGO2 复合物。当肿瘤细胞用 miR - 1246 抑制剂处理后，PTPN6 mRNA 的任何结构域都不再与 AGO2 结合。对 CDS 结合位点进行突变后，突变的 CDS 不再能够结合 miR - 1246 - AGO2 复合物。在体内实验中，向小鼠皮下肿瘤注射抗 miR - 1246（antagomiR - 1246），发现其显著抑制肿瘤生长，增加 CD8⁺T 细胞浸润，且不受 AGO2 水平的影响。

研究还发现，AGO2 - miR - 1246 复合物对 PTPN6 mRNA 的作用不符合典型的 miRNA - mRNA 相互作用模式，IFN-γ 对经典 AGO2/miRNA 复合物的功能没有显著影响，AGO2 - miR - 1246 对 PTPN6 的作用可能是由于 IFN-γ 相关的特定 miRNA 识别元件（MREs）的特异性。

干预 AGO2 协同提高癌症免疫治疗疗效

众多临床数据表明免疫治疗在癌症治疗中取得了突破，但仅一小部分患者能获得显著且长期的疗效，其他患者往往出现原发性或获得性耐药。为了探究靶向 AGO2 是否能进一步提高免疫治疗疗效，研究人员使用了 MB49、MC38（结直肠癌模型）和 B16（黑色素瘤模型）三种小鼠肿瘤免疫模型。给皮下荷瘤小鼠分别用抗 PD - 1 抗体或 AGO2 抑制剂（BCI - 137）处理，发现 PD - 1 抗体与 BCI - 137 联合治疗产生了更好的治疗效果，在三种小鼠模型中均显示肿瘤体积减小。联合治疗还增加了 CD8⁺T 细胞浸润，提高了浸润的 CD8⁺T 细胞效应分子的表达，延长了小鼠生存期，且未导致小鼠体重减轻。使用 antagomiR - 1246 也得到了一致结果。这些数据表明 AGO2 是增强抗肿瘤免疫和免疫治疗的潜在靶点。

研究讨论

本研究发现 AGO2 通过稳定 PTPN6 mRNA 抑制肿瘤细胞对 IFN-γ 信号通路的应答，从而破坏 CD8⁺T 细胞功能的正反馈回路。IFN-γ 依赖的 miR - 1246 表达上调对 AGO2 介导的 PTPN6 mRNA 稳定至关重要。研究还在内部和外部队列中验证了 AGO2 对免疫治疗的影响，并在多个临床前小鼠模型中证明了 AGO2 抑制剂与抗 PD - 1 免疫治疗的协同效应。这些发现揭示了 IFN-γ 信号通路的一种 AGO2 依赖的自我调节机制，支持了靶向 miRNA 传感器 AGO2 可以缓解 IFN-γ 信号通路的自我抑制，从而提高免疫治疗疗效的观点。

激活 IFN-γ 信号通路是免疫治疗效率的核心方面之一，但 IFN-γ 治疗存在副作用。识别和靶向 IFN-γ 信号通路关键节点的负调节因子，可能比单纯补充 IFN-γ 治疗更具临床应用前景。

本研究也存在一些局限性。PTPN6 转录本稳定的机制尚不清楚，miR - 1246 与 PTPN6 CDS 相互作用介导非典型反应（促进 RNA 稳定）的机制还远未明确。AGO2 有几个同源家族（AGO1、AGO3 和 AGO4），它们的功能是否会补偿 AGO2 的缺失并在宏观水平上影响下游转录和翻译途径，需要进一步研究。此外，虽然 CD8⁺T 细胞是公认的肿瘤杀伤主要执行者，但 Ago2 基因敲除对其他免疫细胞浸润和激活的潜在调节作用仍需进一步研究。AGO2 抑制剂 BCI - 137 在人体中的毒性和副作用也需要进一步研究。