CRISPR/Cas 技术打造抗地塞米松的 CAR-T 细胞，为 EBV 相关疾病治疗带来新希望

《Experimental Hematology & Oncology》：All-in-one CRISPR/Cas-engineered glucocorticoid-receptor knock-out EBV-gp350-CAR knock-in T cells are potent and resistant to dexamethasone

研究人员用 CRISPR/Cas 技术构建抗 EBV 的 CAR-T 细胞并敲除糖皮质激素受体，其有效且抗地塞米松，为相关疾病治疗提供新方案。

　　爱泼斯坦 - 巴尔病毒（Epstein-Barr virus，EBV）在免疫功能低下的患者和移植后患者体内的重新激活，就像一颗隐藏在身体里的 “定时炸弹”，会引发各种恶性疾病，严重威胁着人们的生命健康。在对抗 EBV 的战斗中，T 细胞本应是 “主力军”，但移植后的免疫抑制治疗却像给 T 细胞 “戴上了枷锁”，让它们难以发挥作用。而且，糖皮质激素作为常用的免疫抑制剂，不仅会抑制免疫系统对 EBV 的监视，还会直接促进 EBV 的复制，这无疑是 “雪上加霜”。在这样的困境下，寻找一种有效的治疗方法迫在眉睫。

来自德国多家研究机构的研究人员挺身而出，开展了一项极具创新性的研究。他们利用 CRISPR/Cas 介导的一体化方法，在符合药品生产质量管理规范（Good Manufacturing Practice，GMP）的平台上，将抗 EBV（gp350）的嵌合抗原受体（Chimeric Antigen Receptor，CAR）插入 T 细胞受体（T-cell receptor，TRAC）位点，同时敲除糖皮质激素受体（Glucocorticoid Receptor，GR）。这项研究成果意义重大，为无病毒的、抗糖皮质激素的 CAR-T 细胞产品的生产提供了概念验证，有望为移植后 EBV 激活的高风险患者以及需要类固醇治疗的 EBV 相关疾病患者带来新的希望。该研究成果发表在《Experimental Hematology & Oncology》上。

为了开展这项研究，研究人员主要运用了以下关键技术方法：首先是细胞培养技术，从健康供体获取外周血单个核细胞（PBMCs），并培养多种细胞系用于后续实验；其次是 CRISPR/Cas 基因编辑技术，通过设计特定的向导 RNA（gRNA），实现对 TRAC 位点的 CAR 敲入和 GR 基因的敲除；然后是多种检测技术，如通过 PCR 和流式细胞术检测 CAR 敲入效率，蛋白质免疫印迹法（Western blot）检测 GR 敲除效率，还有多种实验评估细胞的功能，包括细胞毒性、增殖能力和细胞因子分泌等 。

下面来看看具体的研究结果：

1. 一体化 CRISPR/Cas 介导生成 gp350-CAR^KITCR^KOGR^KO细胞：研究人员成功升级了基因敲除方法，使其更符合 GMP 标准。新方法的 GR 敲除效率高达 88.4%，TCR 敲除效率为 86.7%，且不影响细胞活力和扩增。同时，CAR 敲入效率平均为 41.2%，额外的 GR 敲除对其影响不大。此外，在细胞群体中，CD8⁺gp350-CAR T 细胞的比例显著高于 CD4⁺gp350-CAR T 细胞12。
2. GR 敲除的 CAR^KI细胞与 GR 野生型 CAR 细胞的功能表征：研究发现，GR 敲除不会损害 CAR^KI T 细胞对表达 gp350 的靶细胞的特异性细胞毒性。而且，CAR^KIGR^KO细胞在与表达 gp350 的细胞共培养时，增殖能力更强，能分泌更多的细胞毒性标记物和细胞因子。此外，无论是 CAR^KIGR^KO细胞还是 GR 野生型 CAR^KI细胞，在与 EBV 驱动的恶性细胞系共培养时，都能检测到细胞因子的显著上调，证明了它们对这些靶细胞的识别能力34。
3. GR 敲除挽救地塞米松处理后的 CAR-T 细胞活性：实验表明，地塞米松会严重抑制 GR 野生型 CAR-T 细胞中 IFNγ 和 TNFα 的表达，但 GR 敲除能显著恢复这些细胞因子的表达，并且不影响 CAR^KIGR^KO T 细胞的增殖能力。同时，地塞米松处理还会富集 GR 敲除细胞，经过 7 天地塞米松处理，GR 野生型细胞会被完全清除56。
4. CAR^KIGR^KO细胞对免疫抑制的非 GR 依赖性敏感性：为确保患者安全，研究人员测试了一种非 GR 依赖性免疫抑制药物环孢素 A（Cyclosporine A，CsA）对 CAR-T 细胞的影响。结果发现，GR 敲除的细胞对 CsA 敏感，随着 CsA 剂量增加，IFNγ 和 TNFα 的分泌会受到抑制，这为控制 CAR-T 细胞的过度激活提供了一种潜在的挽救治疗方法78。

综合来看，这项研究意义非凡。研究人员通过 CRISPR/Cas 技术实现了高效的基因编辑，获得的 T 细胞既具有强大的靶向特异性，又对糖皮质激素具有抗性。这不仅为治疗移植后 EBV 激活或 EBV 相关疾病提供了新的治疗选择，也为 GMP 兼容的 CRISPR/Cas 工程生成抗糖皮质激素的 CAR-T 细胞产品奠定了基础。不过，目前该研究仍处于前期阶段，这种一体化的 gp350-CAR GR 敲除 T 细胞产品在体内的有效性和安全性还需要进一步研究，期待未来能有更多的突破，让这项研究成果真正造福患者。