综述：人类生殖细胞系的建立与调控

《Stem Cell Research & Therapy》：The establishment and regulation of human germ cell lineage

这篇综述聚焦人类生殖细胞系，总结体外诱导模型及调控机制，为相关研究提供思路。

　　# 人类生殖细胞系的建立与调控研究进展

引言

生殖细胞是负责跨代传递遗传和表观遗传信息的特殊细胞类型，是有性生殖和物种延续的基础。在哺乳动物中，生殖细胞通过后成论机制产生，即早期胚胎发育时，由周围体细胞组织的外部信号诱导生殖细胞命运。原始生殖细胞（Primordial germ cells，PGCs）的特化是生殖细胞系发育的起始，其后续会经历迁移、性腺形成、配子发生等过程。PGCs 特化异常可能导致不孕不育、生殖细胞肿瘤和出生缺陷等问题。由于研究人类胚胎存在伦理限制和实际困难，目前对人类 PGCs（hPGCs）调控机制的理解主要依赖体外系统，即利用人类多能干细胞（human pluripotent stem cells，hPSCs）分化为 PGC 样细胞（PGC-like cells，PGCLCs）的模型来进行研究。

人类 PGCs 在体内的建立

以往研究多以小鼠 PGCs（mPGCs）为模型来了解人类 PGC 发育，但越来越多证据表明，人类和小鼠在 PGC 特化机制上存在差异。非人灵长类动物模型因与人类进化关系更近、胚胎形态相似，对研究人类生殖系发育具有重要价值。例如，食蟹猴的 PGCs（cyPGCs）在胚胎第 11 天（E11）于早期羊膜中被发现，且持续表达 PGC 标记物。

目前对 hPGCs 在体内建立的认知，还来源于体外受精胚胎和少量胎儿样本。hPGCs 在受精后约 2 周开始特化，最早可在 E12 - 13 被组织学观察到。随着研究深入，发现了调控 hPGCLC 特化的关键因子，基于此建立了一系列 hPGCLC 系统。

hPSC 体外诱导 PGCLC 策略的发展

3D 悬浮聚集体中 hPGCLCs 的诱导

在胚胎发育过程中，PGCs 在 3D 环境中与周围体细胞相互作用并特化。因此，研究人员设计了悬浮培养系统来诱导 PGC 命运。“4i” 方法中，hPSCs 在 4 - 抑制剂（4i）培养基中培养，添加 BMP2 或 BMP4 等生长因子可诱导其分化为 hPGCLCs，该方法可靠性高，并发现 SOX17 是 hPGC 命运的关键决定因子。

iMeLC 方法则先将 hPSCs 转化为初始中胚层样细胞（iMeLCs），再转移至含 BMP4 等生长因子的 hPGCLC 培养基中进行 3D 聚集诱导。该方法诱导的 hPGCLCs 表达关键生殖细胞标记，为研究 hPGCLC 特化提供了便利可靠的模型。

此外，hPGCLCs 还可直接从具有独特生殖系能力的 “na?ve - primed intermediate” 状态的形成性 PSCs（fPSCs）诱导产生，该方法更为简单，能反映早期胚胎 hPGC 命运诱导过程。同时，na?ve hPSCs 经获能和重置后也可诱导产生 hPGCLCs（rhPGCLCs），其具有独特的转录组和表观遗传特征。

二维（2D）黏附平台上 hPGCLCs 的诱导

3D 聚集系统虽有重要发现，但存在效率低和可扩展性差的问题。为解决这些问题，研究人员开发了在 2D 细胞培养中诱导 hPGCLC 分化的方法。BMEx 覆盖法使用低浓度 BMP4 和弱化的基底膜提取物（BMEx），可在 5 天内以 30 - 50% 的高效率产生 hPGCLCs，且成本效益高，有助于高通量实验。

2D 单层法通过先激活后抑制 WNT 信号通路，可在 3.5 天内从 hPSCs 产生 hPGCLCs，该方法能让细胞更高效接收信号，且通过精确控制信号分子刺激时间窗口，可实现不同 hESC 和 hiPSC 系中 hPGCLCs 的高效、可重复生成。

2D 诱导系统还可通过微图案化 hPSC 模型实现，该模型可精确控制细胞集落大小和形状，仅用 BMP4 处理就能以超 50% 的效率诱导 hPGCLCs，预处理 ACTA 后效率可提高到约 70%。

hPSC 来源的 3D 胚胎样模型诱导 hPGCLCs

尽管 3D 聚集和 2D 黏附策略推动了对人类生殖细胞发育的理解，但与发育中的胚胎相比，它们产生的结构较为无序。为解决这一问题，研究人员采用微流体系统等策略，构建 3D 胚胎样结构来诱导 hPGCLCs。在微流体系统中，hPSCs 可重现人类胚胎植入后上胚层和羊膜发育的关键事件，添加 BMP4 后可产生含早期 hPGCLCs 的后化胚胎样囊（P - ELS）。

另一种创新方法是建立 3D 仿生 hPSC 培养系统（Gel - 3D 方法），该系统利用 3D 细胞外基质（ECM）覆盖和 ECM 凝胶床模拟人类植入周围上胚层环境，促进 hPSCs 分化为羊膜外胚层样细胞（AMLCs），进而诱导 hPGCLC 特化。

hPGCLCs 的诱导及体外配子发生的应用

目前，4i 或 iMeLC 方法诱导新生 hPGCLCs 的效率仅约 20%，2D 方法的出现降低了 hPGCLC 诱导技术难度，提高了诱导效率和细胞数量。微流体方法为 hPGCLC 诱导提供了新的实验途径和视角，其模拟体内环境，有助于研究 hPGCLC 诱导的调控机制。

hPGCLCs 从 hPSCs 诱导产生的研究表明，hPGC 命运可能从与体内 hPGC 特化时期围植入期胚胎细胞对应的形成期细胞中指定，且细胞间接触、细胞外基质硬度和独特的表观遗传景观等因素可能影响诱导效率，为改进 hPGCLC 诱导系统提供了方向。

此外，研究人员尝试将 hPGCLCs 进一步分化为后期生殖细胞，以实现体外配子发生。如将 hPGCLCs 与 hESCs 来源的后肠类器官共培养，可诱导其表达 DAZL 和 DDX4 等晚期 hPGC 标记；与小鼠新生胚胎的卵巢体细胞共培养，可生成类人卵原细胞；调节 BMP 信号通路，可诱导 hPGCLCs 分化为有丝分裂的精原细胞或卵原细胞样细胞。

hPGCLC 特化的协同信号通路调控

早期胚胎发生过程中，细胞谱系分配由关键信号通路和发育调节转录因子控制。在哺乳动物中，生殖细胞特化由周围体细胞组织的特定信号启动，主要信号通路包括 BMP 家族、WNT 和 TGF - β 信号通路，它们在进化上较为保守。

BMP 家族信号通路对 PGCs 的重要性在小鼠研究中得到深入阐释，在 hPGCLC 诱导系统中，BMP4 和 BMP2 足以诱导 hPGCLC 命运，缺乏 BMP4 则无法观察到 hPGCLCs。WNT 和 TGF - β 信号通路也参与生殖细胞特化，在小鼠中，Wnt3 协助上胚层对 Bmp4 的反应，在 hPGCLC 诱导中，抑制 TGF - β 和 WNT 信号会完全阻止 hPGCLCs 的诱导。

这些信号通路共同作用，使前体细胞具备生殖细胞系能力，确保生殖细胞系的精确分化，为配子发生奠定基础。

转录因子对 hPGCLCs 特化和发育的调控

外源信号通路通过激活下游转录因子来指定 PGC 命运。虽然小鼠和人类对这些信号的需求在 PGC 特化中具有保守性，但决定 hPGC 命运的基因调控网络存在差异。

EOMES 是 hPGCLC 能力的关键因子，由 WNT 和 TGF - β 信号调节，在 hPGCLC 特化中作用于 SOX17 上游。OTX2 则是限制生殖细胞系进入的负调控因子。SOX17 和 TFAP2C 是 hPGCLC 命运特化的关键调节因子，SOX17 对 hPGCLC 诱导不可或缺，TFAP2C 在 hPGCLCs 中确保 na?ve - 样多能性，且在 hPGCLC 特化中作用于 SOX17 上游。

PRDM1 对 hPGCLCs 的渐进发育至关重要，PAX5、OCT4 和 PRDM1 形成的网络在 hPGCLCs 特化中起核心作用，抑制非生殖系基因表达，促进生殖细胞命运决定。GATA2 和 GATA3 是 BMP4 的直接效应因子，对 hPGCLC 特化至关重要，GATA3 在分化过程中作用更突出。

PRDM14 在小鼠 PGC 特化中起核心作用，在人类中对 hPGCLC 特化和维持也很重要。SOX15 对 hPGCLCs 的维持至关重要，通过调节 ETV5 等下游因子发挥作用。这些转录因子相互作用，精确指定 hPGC 命运，促进生殖细胞的渐进分化。

生殖细胞系发育中的表观遗传重编程

除细胞外信号和转录因子外，表观遗传调控在生殖细胞系发育中也起着关键作用。在人类生殖细胞系发育过程中，DNA 甲基化经历显著重编程，PGCs 特化和迁移时，DNA 甲基化水平大幅下降，主要通过抑制 DNA 甲基转移酶实现，同时 TET 酶催化 5 - 甲基胞嘧啶（5mC）转化为 5 - 羟甲基胞嘧啶（5hmC）。

组蛋白修饰是另一层表观遗传调控，在 PGC 向生殖嵴迁移过程中，关键组蛋白修饰发生动态重组。如 H3K9me2 逐渐减少，H3K27me3 呈现独特的时间模式，hPGCs 在发育过程中 H2A/H4R3me2s 水平保持恒定。

此外，转座子相关的表观遗传调控也不容忽视。TRIM28 对 hESCs 分化为 hPGCLCs 很重要，可沉默 HERVH 和 SVA，调节相关元件的 DNA 甲基化和染色质状态。LTR5Hs 作为人类特有的转座元件，在生殖系发育中起增强子作用，促进 hPGC 特化。

hPGC (LC) s 的双起源假说

目前基于 hPSCs 的体外模型为研究 hPGCLCs 提供了平台，但对于 hPGCs 在人类胚胎中的起源问题仍未明确。小鼠中，PGCs 起源于 E6 左右的近端后上胚层。由于人类胚胎在 2 - 4 周研究受限，以往对 hPGCs 起源的理解多基于小鼠研究推断。

食蟹猴研究发现，cyPGCs 最早在 E11 于羊膜中出现，挑战了以往对 hPGCs 起源的认知。猪胚胎研究表明，猪 PGCs（pPGCs）在 E11.5 - E12 于新生原条后端特化，起源于原肠胚形成细胞（前中内胚层细胞）。这些研究表明，人类、猴子和猪的 PGC 命运可能源于原肠胚形成细胞，但灵长类 PGCs 也可能起源于羊膜。

利用多种 hPGCLCs 体外模型进一步研究发现，单细胞 RNA 测序（scRNA - seq）分析支持 hPGCLCs 的双起源假说，微流体系统追踪发现 hPGCLC 祖细胞可能来源于新生 AMLCs，但由于技术限制，不能排除其他来源。目前研究倾向于认为羊膜和原肠胚形成的上胚层均可能是 hPGC 命运特化的前体，但仍需更多研究确定。

总结与展望

hPSCs 来源的 hPGCLC 模型是研究 hPGCs 的重要工具，有助于建立体外配子发生模型，解决不孕不育、生殖细胞肿瘤和出生缺陷等临床问题。目前已开发多种体外诱导 hPGCLCs 的方法，包括 3D 聚集和 2D 黏附系统等，但与小鼠相比，hPGCLCs 的渐进分化仍有待加强。

这些模型揭示了与小鼠不同的生殖系调控网络，细胞外信号通路、转录因子和表观遗传因子在 hPGCLC 特化和细胞命运维持中的作用仍在研究中。hPSC - 基于的 hPGCLC 模型为 hPGCs 起源研究提供了有价值的见解，但双起源假说仍需进一步研究确定。

在研究方法上，scRNA - seq 分析有助于克服传统 RNA - seq 分析的局限性，更好地剖析转录因子等关键因子的分子机制，结合空间基因组学将为生殖细胞系特化和分化过程提供更深入的理解。此外，RNA 结合蛋白介导的转录后调控在 PGC 发育中的作用也值得深入研究，有望揭示 hPGCLC 特化和分化的新机制，为体外配子发生和相关疾病研究提供更多理论支持。