间充质干细胞来源的细胞外囊泡通过调控 miR-99b-5p/mTOR/ 自噬轴缓解糖尿病肾病肾纤维化

《Stem Cell Research & Therapy》：Extracellular vesicles derived from mesenchymal stem cells alleviate renal fibrosis via the miR-99b-5p/mTOR/autophagy axis in diabetic kidney disease

为探究间充质干细胞外泌体（EVs）对糖尿病肾病（DKD）的治疗效果，研究发现其可通过 miR-99b-5p/mTOR/ 自噬轴缓解肾损伤，提供新治疗策略。

　　在当今社会，糖尿病的发病率日益攀升，而糖尿病肾病（DKD）作为糖尿病最严重的微血管并发症之一，正逐渐成为全球范围内导致终末期肾病（ESRD）的主要原因。DKD 患者不仅面临着肾脏功能逐渐衰竭的困境，还伴随着心血管疾病发病和死亡风险的显著增加，这无疑给临床治疗带来了巨大挑战。目前，针对 DKD 的治疗手段十分有限，因此，探索更为有效的治疗策略迫在眉睫。

为了攻克这一难题，来自郑州第七人民医院、南开大学医学院、新乡医学院、中国人民解放军总医院等多家机构的研究人员展开了深入研究。他们将目光聚焦于间充质干细胞（MSCs）来源的细胞外囊泡（EVs），试图揭示其在 DKD 治疗中的潜在价值。相关研究成果发表在《Stem Cell Research 》上。

研究人员采用了多种关键技术方法。在细胞和动物实验方面，他们培养了人胎盘间充质干细胞（hP-MSCs）和小鼠肾小球系膜细胞（mMCs），并建立了链脲佐菌素（STZ）诱导的糖尿病小鼠模型。通过超速离心法分离 hP-MSCs 来源的 EVs，运用透射电子显微镜（TEM）、动态光散射（DLS）和蛋白质免疫印迹（Western blot）等技术对 EVs 进行表征。此外，还利用实时荧光定量聚合酶链式反应（RT-qPCR）、免疫组化、免疫荧光、蛋白质免疫印迹等方法检测相关分子的表达水平 ，以此来探究 EVs 对 DKD 的治疗效果及机制。

研究结果如下：

1. MSC-EVs 的特征：成功从 hP-MSCs 培养上清中分离出 EVs，TEM 显示其呈典型的圆形杯状膜结构，DLS 分析其平均直径为 114.41nm，Western blot 证实其表达 EV 相关标记蛋白 CD9、TSG101 和 Alix，而不表达 MSC 标记蛋白 calnexin。
2. MSC-EVs 对 STZ 诱导的糖尿病小鼠肾脏的保护作用：建立 STZ 诱导的 DKD 小鼠模型后，尾静脉注射 MSC-EVs。结果发现，MSC-EVs 虽对血糖水平无明显影响，但能显著降低糖尿病小鼠的相对肾脏重量、蛋白尿和血清肌酐水平，减轻肾小球肥大、系膜基质增多和肾小球基底膜增厚等病理变化，减少增殖细胞核抗原（PCNA）阳性细胞数量和胶原沉积，抑制 α- 平滑肌肌动蛋白（α-SMA）、纤连蛋白和胶原蛋白 IV 的表达。同时，MSC-EVs 还能促进糖尿病小鼠肾脏中自噬的激活，表现为 LC3II/I 比值升高和 p62 水平降低 。这表明 MSC-EVs 可缓解 DKD 诱导的肾损伤和纤维化，并促进肾脏自噬。
3. MSC-EVs 对 HG 诱导的系膜细胞的影响：在体外实验中，用高糖（HG）诱导 mMCs，再给予 MSC-EVs 处理。CCK-8 实验、EdU 实验和 Western blot 结果表明，MSC-EVs 能抑制 HG 诱导的 mMCs 增殖，降低 PCNA 表达。免疫荧光染色和 RT-qPCR 结果显示，MSC-EVs 可抑制 HG 诱导的 mMCs 中 α-SMA、纤连蛋白和胶原蛋白 IV 的表达，减少细胞外基质（ECM）积累。此外，MSC-EVs 还能促进 HG 诱导的 mMCs 中自噬，表现为 LC3II/I 比值升高和 p62 水平降低。由此可见，MSC-EV 处理可促进自噬，抑制 HG 诱导的系膜细胞增殖和 ECM 积累。
4. miR-99b-5p 在 MSC-EVs 介导的治疗中的作用：通过生物信息学分析预测，mTOR 是 miR-99b-5p 的靶基因。实验证实，MSC-EVs 可被 mMCs 内化，使 mMCs 中 miR-99b-5p 表达上调，mTOR 表达下调。敲低 miR-99b-5p 后，mTOR 表达增加。功能实验表明，miR-99b-5p 通过抑制 mTOR 表达，促进自噬，抑制 HG 诱导的 mMCs 增殖和 ECM 积累。在体内实验中，给 STZ 诱导的糖尿病小鼠注射含有 miR-99b-5p 的 MSC-EVs（EVs-NC）或敲低 miR-99b-5p 的 MSC-EVs（EVs-KD），结果显示 EVs-NC 能改善糖尿病小鼠的肾功能，减轻肾脏病理变化，抑制 mTOR 表达，促进自噬；而 EVs-KD 则加重肾脏损伤。这表明 miR-99b-5p 通过 mTOR 介导的自噬，改善 DKD 小鼠的肾脏损伤和纤维化。

研究结论和讨论部分指出，本研究表明 hP-MSCs 来源的 EVs 可有效抑制肾小球系膜细胞增殖和 ECM 积累，减轻肾脏损伤和纤维化，其机制是通过传递 miR-99b-5p，抑制 mTOR 表达，促进自噬。这一发现为 DKD 的治疗提供了一种有前景的无细胞治疗策略。然而，该研究也存在一定局限性，如未明确 MSC-EVs 中其他成分对 DKD 的影响，且需要探索提高 MSC-EVs 肾脏靶向性的新策略，以及进一步研究其对肾小管间质纤维化的影响及机制。尽管如此，该研究成果仍为 DKD 的治疗开辟了新的方向，有望在未来为临床治疗带来新的突破。