细菌实现从葡萄糖合成松香烷型二萜铁锈醇，开辟生物制造新路径

《Microbial Cell Factories》：Bacterial biosynthesis of abietane-type diterpene ferruginol from glucose

为解决植物提取二萜类化合物的供应问题，研究人员对谷氨酸棒杆菌进行代谢工程改造，成功生产出铁锈醇，为二萜生物合成研究奠定基础。

　　# 细菌 “变身” 工厂：从葡萄糖到铁锈醇的神奇之旅
在传统的医药领域，许多珍贵的植物提取物发挥着重要作用。其中，铁锈醇（Ferruginol，C20?H30?O）作为一种松香烷型三环二萜，源自中药材丹参的树皮和根部，数百年来一直用于心脑血管疾病的治疗，近年来还发现其具有抗癌活性，备受关注。然而，获取铁锈醇的传统方法 —— 植物提取，却面临诸多困境。一方面，植物提取的产量较低，难以满足日益增长的市场需求；另一方面，气候变化对植物生长的影响，导致其供应稳定性大打折扣。因此，寻找一种可持续的铁锈醇生产方式迫在眉睫。

来自韩国成均馆大学（Sungkyunkwan University）的研究团队，敏锐地捕捉到这一问题，展开了深入研究。他们的研究成果发表在《Microbial Cell Factories》杂志上，为铁锈醇的生产带来了新的曙光。

在这项研究中，研究人员运用了多种关键技术方法。首先是基因编辑技术，利用高保真胞嘧啶碱基编辑器（HF - CBESTOP）对谷氨酸棒杆菌（Corynebacterium glutamicum）进行基因编辑，精准地敲除了 pyc 和 crtB 基因 ，构建出 HL01 菌株。其次是质粒构建技术，构建了多个含有不同功能基因模块的质粒，用于优化代谢途径。此外，还运用了气相色谱 - 质谱联用（GC - MS）和气相色谱 - 火焰离子化检测（GC - FID）技术对产物进行定量分析，以及共聚焦显微镜技术观察蛋白表达和定位。

下面，让我们详细了解一下研究人员的发现。

合成代谢途径模块构建

研究人员对谷氨酸棒杆菌的天然代谢途径进行改造，旨在提高丙酮酸和香叶基香叶基焦磷酸（GGPP）的水平。通过敲除编码丙酮酸羧化酶的 pyc 基因和编码八氢番茄红素合酶的 crtB 基因，成功构建了 HL01 菌株。随后，他们构建了四个关键的模块：OverMEP 模块，过表达 MEP 途径中的关键酶 1 - 脱氧 - 木酮糖 - 5 - 磷酸合酶（Dxs）和异戊烯基焦磷酸异构酶（Idi），促进异戊烯基焦磷酸（IPP）的合成；开发了三种不同的 GGPP 合酶（GGPPS）模块，分别涉及过表达谷氨酸棒杆菌的天然 idsA 基因、加拿大红豆杉的 GGPPS 基因，以及酿酒酵母的 Bts1 - ERG20 (F96C) 融合蛋白基因；DiTPS 模块，选择丹参中的 CPS 基因和 KSL 基因，促进 GGPP 向迷迭香二烯的转化；P450R 模块，将丹参中的 CYP76AH1 和 CPR1 基因整合到 DiTPS 模块中，实现从迷迭香二烯到铁锈醇的转化。

异源生产迷迭香二烯和阿比特三烯

研究人员构建了携带不同模块组合的 HL01 菌株，以 2% 葡萄糖为唯一碳源培养 48 小时后，检测到迷迭香二烯和阿比特三烯（迷迭香二烯的氧化副产物）的存在。通过以铁锈醇为标准品进行定量分析，发现不同模块组合的产量有所差异。其中，pBE - DI 和 pCK 模块组合在 48 小时时，每克干细胞重量（gDCW）可产生 4.5 ± 1.0 毫克迷迭香二烯（以铁锈醇当量计）和 0.63 ± 0.1 毫克阿比特三烯（以铁锈醇当量计）。并且，研究发现添加额外的葡萄糖可提高二萜产量。在补料分批发酵中，持续补加葡萄糖，迷迭香二烯（以铁锈醇当量计）在 96 小时时浓度达到 126.7 ± 0.9 毫克 / 升。此外，表达融合的 KSL 和 CPS 酶，以及使用截短版本的 KSL 和 CPS 酶，可提高催化效率和促进可溶性蛋白表达，使迷迭香二烯产量在 48 小时时提高 1.26 倍。

提高二萜产量

在补料分批发酵过程中，研究人员发现随着葡萄糖的耗尽，迷迭香二烯及其衍生物阿比特三烯的产量会下降。推测是由于迷迭香二烯在培养过程中可能发生非酶促降解。为解决这一问题，他们采用连续葡萄糖进料的策略，成功增加了迷迭香二烯（以铁锈醇当量计）的浓度，在 96 小时时达到 154.5 ± 11.8 毫克 / 升 。

异源生产铁锈醇

研究人员在生产迷迭香二烯的 HL01 菌株中，共表达 P450R 模块。通过共聚焦显微镜分析发现，完整的 CYP76AH1 蛋白在细胞膜上表达，而截短版本的则定位于细胞质中。实验结果显示，只有携带完整 P450R 模块（pBE - DI ptKtC - CP450CR）的菌株能够产生铁锈醇。在不同葡萄糖进料条件下，该菌株中迷迭香二烯的相对水平在 48 小时时显著下降，部分转化为铁锈醇。在持续葡萄糖进料条件下，铁锈醇的含量在 96 小时时达到 6.23 ± 0.2 毫克 / 克干细胞重量，浓度达到 107.34 ± 1.2 毫克 / 升。

研究人员成功构建了能够异源生产迷迭香二烯的谷氨酸棒杆菌菌株，通过模块整合首次实现了细菌中铁锈醇的生产。这一成果为通过代谢途径工程和模块整合优化二萜生物合成开辟了新道路，为未来可持续生产天然二萜类化合物提供了新的策略和方向。虽然目前铁锈醇的产量还需要进一步优化发酵条件和扩大生产规模来提高，但这项研究无疑为相关领域的发展奠定了坚实的基础，有望推动生物制造产业的进步，为医药领域提供更多可持续的解决方案。