脐带间充质干细胞外泌体 miR-499a-5p：治疗肝纤维化的新希望

《Journal of Nanobiotechnology》：Exosomal miR-499a-5p from human umbilical cord mesenchymal stem cells attenuates liver fibrosis via targeting ETS1/GPX4-mediated ferroptosis in hepatic stellate cells

为探究人脐带间充质干细胞（hUC-MSCs）治疗肝纤维化机制，研究发现其外泌体 miR-499a-5p 可缓解肝纤维化。

　　肝纤维化是全球范围内导致肝脏相关死亡的主要原因之一，它是肝脏在遭受慢性和反复损伤后启动的异常修复过程。若不加以控制，肝纤维化会逐渐发展为肝硬化，最终导致不可逆的肝衰竭和肝细胞癌。目前，针对肝纤维化的有效治疗方法仍然有限，这使得寻找新的治疗策略成为医学领域的迫切需求。

在此背景下，武汉大学人民医院等机构的研究人员开展了一项旨在探究 hUC-MSCs 治疗肝纤维化机制的研究。他们发现，hUC-MSCs 通过外泌体介导的 miR-499a-5p 传递，靶向 ETS1/GPX4 信号通路，促进肝星状细胞（HSCs）发生铁死亡（一种由细胞内铁积累导致脂质过氧化和活性氧物种（ROS）积聚的细胞死亡方式），进而抑制 HSCs 的激活，最终缓解肝纤维化。这一发现为肝纤维化的治疗提供了新的理论依据和潜在的治疗靶点，在肝纤维化治疗领域具有重要意义。该研究成果发表在《Journal of Nanobiotechnology》杂志上 。

研究人员在此次研究中运用了多种关键技术方法。在动物实验方面，构建了四氯化碳（CCl₄）和硫代乙酰胺（TAA）诱导的小鼠肝纤维化模型，用于观察 hUC-MSCs 及相关干预措施对肝纤维化的影响。在细胞实验中，进行了 RNA 测序，以分析基因表达变化；运用免疫荧光分析，观察相关蛋白的表达和定位；采用分子对接分析，探究蛋白与基因启动子之间的相互作用模式。

下面来详细了解一下具体的研究结果：

• MSCs 缓解小鼠肝纤维化：研究人员首先对购买的 MSCs 进行体外实验，通过油红 O、茜素红和阿尔新蓝染色，证实了其具有向脂肪细胞、成骨细胞和软骨细胞分化的能力；利用流式细胞术，验证了其 MSC 表型。随后，构建了 CCl₄和 TAA 诱导的小鼠肝纤维化模型，并对小鼠进行分组处理。结果发现，接受 MSCs 治疗的小鼠体重增加，肝组织中 CD73 和 CD90 水平升高，表明 MSCs 成功归巢到肝脏。此外，MSCs 治疗显著改善了肝组织的病理变化，降低了血清中谷丙转氨酶（ALT）、谷草转氨酶（AST）和碱性磷酸酶（ALP）水平，增加了白蛋白（ALB）水平，提示肝纤维化得到缓解。
• MSCs 抑制肝纤维化组织中的铁死亡：通过对肝组织样本进行 RNA 测序，研究人员发现 MSCs 治疗后，许多与氧化应激反应、铁离子结合以及铁死亡相关的基因表达发生了改变。进一步的蛋白检测和生化分析表明，MSCs 治疗可降低肝组织中的血清铁和丙二醛（MDA）水平，增加超氧化物歧化酶（SOD）水平，减少脂质过氧化，这表明 MSCs 可能通过调节铁死亡来发挥其治疗作用。
• MSCs 通过诱导铁死亡抑制 HSCs 激活：免疫荧光分析显示，MSCs 治疗后，HSCs 中 Cox2 表达降低，且与 α-SMA 的共定位增加，表明 MSCs 促进了 HSCs 的铁死亡。CCK-8 实验表明，MSCs 条件培养基（MSCs-CM）处理会降低 mHSCs 和 LX-2 细胞的活力，而铁死亡抑制剂 Fer-1 可部分恢复细胞活力。此外，与 MSCs 共培养的 HSCs 中，纤维化标记物的 mRNA 表达降低，铁死亡标记物的 mRNA 表达增加，同时 ROS 生成增加，线粒体膜电位降低，这些结果均表明 MSCs 可诱导 HSCs 发生铁死亡，从而抑制其激活。
• MSCs 通过下调 GPX4 诱导 HSCs 铁死亡：研究人员通过对 RNA 测序数据的分析，发现 MSCs 可能调节 30 个上调和 22 个下调的铁死亡相关基因，其中 GPX4 基因在肝纤维化过程中显著上调。进一步实验证实，MSCs 可下调 GPX4 的表达，而敲低 GPX4 会导致 HSCs 中 Fe²⁺和 MDA 水平升高，纤维化标记物表达降低，铁死亡标记物表达增加，这表明 GPX4 的下调会影响 HSCs 中与铁死亡和纤维化相关基因的表达，进而影响肝纤维化的进程。
• MSCs 通过外泌体途径促进 HSCs 铁死亡：研究人员提取并鉴定了 MSCs 的外泌体（MSC-Exos），发现其具有典型的杯状双层膜结构，平均粒径为 85.2nm。实验表明，MSC-Exos 能够被 mHSCs 和 LX-2 细胞摄取，且其作用与 MSCs 相似。用 GW4869 预处理 MSCs 可抑制 MSC-Exos 诱导的 HSCs 铁死亡和失活，体内实验也证实了 MSC-Exos 可减轻肝组织的炎症细胞浸润和胶原沉积，表明 MSC-Exos 可诱导 HSCs 发生铁死亡，从而缓解肝纤维化。
• Exos 中的 miR-499a-5p 通过下调 GPX4 促进 HSCs 铁死亡：对共培养条件下的 mHSCs 进行 miRNA 测序，研究人员发现了两种显著上调的 hsa-miRNAs，即 hsa-miR-499a-5p 和 hsa-miR-127-5p。由于 miR-499a-5p 的靶基因与转录调控密切相关，研究人员对其进行了深入研究。实验结果显示，转染 miR-499a-5p 模拟物可下调 GPX4 的表达，增加 Fe²⁺和 MDA 水平，诱导 HSCs 发生铁死亡，抑制其激活。
• miR-499a-5p 靶向 ETS1 下调 Exos 处理的 HSCs 中的 GPX4：通过数据库预测和实验验证，研究人员发现 miR-499a-5p 可靶向转录因子 ETS1。双荧光素酶报告基因实验证实了 miR-499a-5p 与 ETS1 的直接相互作用。进一步研究发现，MSC-Exos 干预可下调 ETS1 和 GPX4 的表达，而转染 miR-499a-5p 模拟物或敲低 ETS1 可上调 HSCs 铁死亡标记物的表达，下调纤维化标记物的表达。此外，分子对接分析确定了 ETS1 与 GPX4 启动子的结合位点，ChIP-qPCR 分析证实了 ETS1 与 GPX4 启动子的结合，这些结果表明 miR-499a-5p 通过靶向 ETS1 下调 GPX4，从而调节 HSCs 的铁死亡和纤维化相关基因的表达。
• ETS1 过表达挽救 miR-499a-5p 诱导的铁死亡：研究人员构建了 ETS1 过表达的 mHSCs 和 LX-2 细胞系，进行功能挽救实验。结果显示，ETS1 过表达可部分抵消 miR-499a-5p 介导的铁死亡，降低 Fe²⁺和 MDA 水平，恢复 HSCs 的活性。对人类蛋白质图谱（HPA）数据库的单细胞测序数据分析表明，ETS1 在人肝组织的成纤维细胞中高度表达，提示其参与肝纤维化过程，进一步证明了 ETS1 是 HSCs 铁死亡的关键调节因子和肝纤维化的潜在治疗靶点。

综上所述，该研究揭示了 hUC-MSCs 通过外泌体介导的 miR-499a-5p 传递，靶向 ETS1/GPX4 信号通路，促进 HSCs 铁死亡，从而缓解肝纤维化的新机制。这一发现不仅加深了人们对肝纤维化发病机制的理解，还为肝纤维化的治疗提供了新的潜在靶点和治疗策略。然而，研究也存在一定的局限性，例如难以区分 MSC 来源的外泌体 miR-499a-5p 和内源性 miR-499a-5p。未来，需要进一步研究 hUC-MSCs 在不同微环境中对铁死亡的调节作用，以及这种调节是否依赖特定的信号通路或细胞间相互作用，以优化 MSC-Exos 的应用策略，为肝纤维化的临床治疗提供更有效的方案。