脂质纳米粒（LNP）制备溶液对 mRNA/LNP 性能的关键影响及意义

《Journal of Nanobiotechnology》：Influence of salt solution on the physicochemical properties and in vitro/ in vivo expression of mRNA/LNP

为探究制备溶液对 mRNA/LNP 性能影响，研究人员展开研究，发现关键因素，为优化 LNP 配方提供依据。

　　# 脂质纳米粒（LNP）制备溶液的奥秘：开启 mRNA 疗法优化新征程
在生命科学和医学研究领域，mRNA 疗法宛如一颗璀璨新星，自问世以来便备受瞩目。它在预防传染病传播方面成效显著，为全球公共卫生事业注入强心剂；在治疗癌症时，能够降低晚期黑色素瘤和胰腺癌患者的复发率，给癌症患者带来新希望；还能缓解遗传性罕见病患者的代谢失代偿问题，成为罕见病治疗领域的新曙光。而脂质纳米粒（Lipid nanoparticles，LNPs）作为 mRNA 疗法的 “黄金搭档”，凭借着独特的优势，成为了核酸递送的先进载体。它能够像 “护盾” 一样包裹和保护 mRNA，高效地将其运送至目标细胞，并助力 mRNA 顺利释放，从而实现精准治疗。

然而，在 LNPs 的研发道路上，仍有诸多未知等待探索。过往研究大多聚焦于脂质成分的优化，却忽视了制备溶液这一关键环节对 LNP 性能的潜在影响。目前，不同 mRNA 疫苗存储在不同配方的缓冲溶液中，溶液的 pH 值、盐浓度和盐种类对存储稳定性的影响尚未得到系统研究。而且，在 LNPs 的制备过程中，从 mRNA 水溶液到稀释、交换和存储溶液，每个环节的溶液作用都未被深入探究，这些知识空白如同迷雾，阻碍着 mRNA/LNP 疗法的进一步发展。

为了拨开这层迷雾，上海交通大学医学院附属仁济医院等机构的研究人员挺身而出，开展了一项意义非凡的研究。他们以 FDA 批准的 SM - 102 配方和荧光素酶 mRNA 为模型，系统地探究了四种关键制备溶液对 LNPs 理化性质和表达效率的影响。该研究成果发表在《Journal of Nanobiotechnology》杂志上，为 mRNA/LNP 领域带来了新的突破。

研究人员在研究过程中运用了多种关键技术方法。通过微流控混合技术制备 LNPs，利用动态光散射（DLS）测量其流体动力学直径、聚合物分散指数（PDI）和 zeta 电位，借助冷冻透射电子显微镜（Cryo - TEM）观察形态，采用 Quant - iT? RiboGreen? RNA 试剂检测 mRNA 的包封率（EE）。同时，使用不同细胞系进行体外转染实验，通过动物实验研究体内转染情况，全面评估 LNPs 的性能。

mRNA 水溶液的关键作用

研究人员首先对 mRNA 水溶液展开研究。他们发现，mRNA 水溶液的 pH 值对 LNPs 的理化性质和细胞表达有着至关重要的影响。当 pH 值在 3 - 6 之间变化时，LNPs 的各项指标随之改变。pH 值为 3 时，100 mM 柠檬酸盐溶液（CS）分散 mRNA 的组别 A13 包封率最高，达到 91.8%，但 mRNA 分子在该低 pH 值下可能不稳定。综合考虑，pH 值为 4 时最为适宜，此时不仅能优化包封率，还能促进细胞表达。在不同细胞系中，随着 pH 值从 4 升高到 6，LNPs 的细胞表达呈下降趋势。而盐的类型和浓度对 LNPs 的理化性质和细胞表达影响较小，这表明 pH 值才是 mRNA 水溶液影响 LNPs 性能的关键因素。

稀释液的影响探究

接着，研究人员将目光投向稀释液。他们分别改变稀释液的 pH 值、盐类型和盐浓度进行实验。结果发现，与 mRNA 水溶液相比，稀释液对 LNPs 理化性质的影响较小。在细胞表达方面，除了在 C2C12 细胞中，稀释液的 pH 值对表达有一定影响外，其他情况下影响均不显著。这意味着在 LNPs 的制备过程中，稀释液并非影响其性能的关键环节。

交换溶液的重要影响

随后，研究人员研究了交换溶液的作用。他们对比了交换前后 LNPs 的理化性质，发现交换溶液的 pH 值与 LNPs 的粒径、包封率等理化性质密切相关。在细胞表达层面，pH 值同样起着关键作用，DC2.4 细胞对 pH 值变化最为敏感。综合各项指标，10 mM 磷酸盐溶液（PS）作为交换溶液时，LNPs 的蛋白表达相对较高，因此被选为后续研究的首选交换溶液。

存储溶液的关键作用

最后，研究人员对存储溶液进行了深入探究。存储溶液中的蔗糖含量对 LNPs 的稳定性和细胞表达影响显著。在 DC2.4 细胞中，蔗糖浓度与表达呈正相关，300 mM 蔗糖浓度时 LNP 表达最高。而且，蔗糖浓度还影响着 LNPs 冻融后的稳定性，缺乏蔗糖保护的 LNPs 容易聚集、泄漏 mRNA，而 300 mM 蔗糖能有效减少这些问题。基于此，研究人员选择 300 mM 蔗糖、Tris 作为盐种类、20 mM 作为盐浓度的存储溶液，以确保 LNPs 的稳定性和功能性。

综合影响及结构差异

研究人员还整合了优化后的制备条件，研究多种制备溶液综合作用对 LNPs 的影响。结果表明，这些溶液不仅影响 LNPs 的理化性质和体外转染效率，还对体内蛋白翻译产生影响。交换溶液的 pH 值与肝特异性表达显著相关，提高交换溶液的 pH 值能增强肝脏中的 mRNA 表达。此外，研究人员通过 Cryo - TEM 观察到不同制备条件下 LNPs 的结构存在明显差异，这或许可以解释为何相同脂质成分但不同制备溶液的 LNPs 性能会有所不同。

在这项研究中，研究人员系统地揭示了制备溶液对 SM102 - 基 mRNA/LNPs 的重要影响。mRNA 水溶液的 pH 值是影响包封率和细胞表达的关键因素，pH 值为 4 时最佳；交换溶液的 pH 值对生物分布和肝脏特异性表达至关重要；300 mM 蔗糖可显著提高冻融稳定性。这些发现为优化 mRNA/LNP 配方提供了坚实的理论基础，有助于推动 mRNA 疗法在临床中的广泛应用，为更多患者带来希望。不过，该研究也存在一定局限性，未来还需进一步研究不同 LNP 系统，探索长期存储稳定性等问题，以实现 mRNA/LNP 疗法的更大突破。