发现人类 BCL2L12 基因环状转录本：开启环状 RNA 生物学新篇章

《Functional & Integrative Genomics》：Discovery of circular transcripts of the human BCL2-like 12 (BCL2L12) apoptosis-related gene, using targeted nanopore sequencing, provides new insights into circular RNA biology

研究人员针对结直肠癌，研究 BCL2L12 基因环状转录本，发现新转录本并揭示其调控作用，意义重大。

　　在生命科学的微观世界里，RNA 的神秘面纱正逐渐被揭开。其中，环状 RNA（circRNAs）作为一类特殊的非编码 RNA，以往被认为只是剪接事件的 “副产品”，如同隐藏在基因表达舞台幕后的小人物，未受到足够重视。但随着研究的深入，人们发现 circRNAs 在众多生物学过程中发挥着关键作用，尤其在癌症领域，其与肿瘤的发生、发展紧密相关，这使得 circRNAs 成为科研人员竞相探索的热门领域。

结直肠癌（CRC）是一种常见且死亡率较高的恶性肿瘤，严重威胁着人类健康。在 CRC 的复杂分子机制中，凋亡相关基因的异常表达往往扮演着重要角色。BCL2 - 样 12（BCL2L12）基因作为凋亡调控家族的一员，虽已被发现多年，但围绕其环状转录本的研究却相对匮乏，这就如同在探索 CRC 发病机制的拼图中，缺失了重要的几块。为了填补这一空白，深入了解 CRC 的发病机制，来自希腊雅典国立与卡波迪斯特里亚大学（National and Kapodistrian University of Athens）和德国慕尼黑路德维希 - 马克西米利安大学（Ludwig Maximilian University of Munich）的研究人员展开了一项极具意义的研究。

这项研究成果发表在《Functional & Integrative Genomics》杂志上，为我们揭示了许多关于 BCL2L12 基因环状转录本的新信息，为 circRNA 生物学研究和 CRC 的治疗提供了新的思路与方向。

研究人员主要运用了以下几种关键技术方法：首先是纳米孔测序技术，对 7 种 CRC 细胞系中 BCL2L12 circRNAs 的嵌套 PCR 扩增子进行测序，从而获取大量的测序数据；其次，利用二代测序（NGS）对环状 RNA 富集后的反向剪接接头（BSJ）进行验证，确保研究结果的准确性；此外，还开发了多种生物信息学算法，如 ASDT、ASDT remodeler 和 Read catcher 等，用于分析纳米孔测序数据，识别和分析环状 RNA。

下面来看具体的研究结果：

• 开发新的实验和生物信息学流程：研究人员设计了针对 BCL2L12 每个注释外显子的 2 对发散引物，进行嵌套 PCR。将不同细胞系的 PCR 产物混合纯化后构建纳米孔测序文库，随后运用公开工具和自研算法进行生物信息学分析，成功开发出一种识别新型 circRNAs 的新流程。
• BCL2L12 环状 RNA 的外显子结构和特征：在 CRC 细胞系中，研究人员共鉴定出 46 种 BCL2L12 circRNAs，其中大部分为首次发现。这些 circRNAs 覆盖了 BCL2L12 基因约一半的区域，且与已有的公共数据库中记录的 circRNAs 相比，仅有少数重叠。此外，部分 circRNAs 由单个外显子组成，还有一些包含从未描述过的外显子，这些外显子的频率和覆盖度呈现出独特的特征。
• BCL2L12 环状 RNA 在 CRC 细胞系中的表达谱：通过纳米孔测序数据分析，研究人员发现 BCL2L12 circRNAs 在 7 种 CRC 细胞系中的表达存在显著差异。不同细胞系中 circRNAs 的外显子结构和内含子覆盖情况各不相同，其中外显子 4 和 5 在 circRNAs 中出现的频率较高，但它们在不同细胞系 circRNAs 中的具体结构存在差异。
• 新型 BCL2L12 环状 RNA 的 BSJ 特征及其在 CRC 细胞系中的相对丰度：在 46 种鉴定出的 circRNAs 中，研究人员观察到 40 种不同的 BSJ。大部分 circRNAs 的反向剪接位点是非规范的，且在多数情况下，形成 BSJ 的前体 mRNA 区域具有高度的序列相似性。此外，研究还发现 2 种 circRNAs（circ - BCL2L12 - 9 和 circ - BCL2L12 - 55）包含类似于 mRNA 多聚腺苷酸尾（poly (A) tail）的多聚腺苷酸（poly (A)） tracts，这一发现挑战了传统对 circRNAs 的认知。
• 沉默 circ - BCL2L12 - 92 对 BCL2L12 mRNA 水平的影响：为探究 BCL2L12 circRNAs 对其亲本基因 mRNA 表达的调控作用，研究人员选取了 HCT 116 细胞系，针对其中 4 种包含 BCL2L12 mRNA 3′ - 非翻译区（3′ - UTR）的 circRNAs 设计了 siRNAs。通过双荧光素酶报告基因实验筛选后，对 circ - BCL2L12 - 92 进行沉默实验。结果显示，circ - BCL2L12 - 92 的沉默导致 BCL2L12 mRNA 水平显著下降，表明 circ - BCL2L12 - 92 对 BCL2L12 mRNA 表达具有负调控作用。

研究结论和讨论部分指出，该研究不仅发现了大量来自 BCL2L12 基因的环状转录本，还揭示了它们在不同 CRC 细胞系中的表达多样性。这些 circRNAs 的外显子结构和反向剪接方式表明，circRNAs 的生物发生机制和功能尚未完全明晰，仍有许多未知等待探索。circ - BCL2L12 - 92 对 BCL2L12 mRNA 表达的调控作用暗示了其在 CRC 发病机制中的潜在重要性，为进一步研究 circRNA/miRNA/mRNA 调控轴提供了方向。

然而，研究也存在一些局限性。例如，由于引物设计基于现有注释外显子，可能遗漏仅来源于内含子区域的 circRNAs；仅使用了 CRC 细胞系，无法确定正常结直肠上皮细胞中是否表达这些 circRNAs；纳米孔测序的高错误率可能影响反向剪接位点的确定，且生物信息学分析流程耗时较长等。但尽管如此，这项研究为 circRNA 生物学和 CRC 研究领域提供了宝贵的信息，开启了新的研究方向。未来，研究人员可以进一步优化实验方法，扩大样本类型和数量，深入探究 BCL2L12 circRNAs 的功能和作用机制，为 CRC 的诊断和治疗带来新的突破。