雌激素诱导 circFAM171A1 调控绵羊成肌细胞增殖的分子机制研究

《Cellular and Molecular Life Sciences》：Estrogen-induced circFAM171A1 regulates sheep myoblast proliferation through the oar-miR-485-5p/MAPK15/MAPK pathway

为探究雌激素调控肌肉生长的机制，研究人员构建 ceRNA 网络，发现雌激素通过 circFAM171A1/oar-miR-485-5p/MAPK15 通路促进绵羊成肌细胞增殖，为相关研究提供新视角。

　　在动物的生长发育过程中，肌肉的生长发育一直是生物学家们重点关注的领域。雌激素作为一种重要的激素，在雌性动物肌肉发育中扮演着关键角色。过往研究表明，雌激素能够保护肌肉细胞免受凋亡，然而其调控成肌细胞生长和发育的详细分子机制却始终是个未解之谜。这一空白不仅限制了人们对肌肉发育过程的深入理解，也为相关领域的进一步研究带来了挑战。为了填补这一知识空缺，中国农业科学院的研究人员开展了一项旨在揭示雌激素调控绵羊肌肉生长发育分子机制的研究。

研究人员选取了 10 只 2 月龄的小尾寒羊母羊，随机分为卵巢切除组（OR-STH）和假手术组（STH），在手术后 6 个月收集背最长肌组织样本。通过高通量 RNA 测序技术，对两组样本进行分析，试图找出差异表达的基因。

研究人员首先对 RNA 测序数据进行分析，识别出了大量差异表达的 circRNAs（DECs）、miRNAs（DEMs）和 mRNAs（DEGs）。通过生物信息学分析，发现差异表达基因 MAPK15 在 MAPK 信号通路中显著富集，该通路对肌肉发育至关重要。在此基础上，研究人员构建了 ceRNA 网络 circFAM171A1/oar-miR-485-5p/MAPK15。

为了验证 circFAM171A1 的功能，研究人员构建了过表达和干扰质粒，并将其转染到绵羊原代成肌细胞中。结果显示，过表达 circFAM171A1 显著促进了细胞增殖相关标记物 CDK2、Pax7 和 PCNA 的表达，EdU 染色和 CCK-8 实验也证实了 circFAM171A1 能够促进绵羊成肌细胞的增殖；相反，干扰 circFAM171A1 的表达则抑制了细胞增殖。

通过核质分离和 FISH 实验，研究人员发现 circFAM171A1 主要定位于细胞质中。进一步研究表明，circFAM171A1 可以作为 oar-miR-485-5p 的海绵，结合 oar-miR-485-5p，从而减弱其对 MAPK15 表达的抑制作用。双荧光素酶报告实验、RNA pull-down 实验等都验证了这一结合关系。

研究人员还发现，雌激素能够诱导绵羊成肌细胞中 circFAM171A1 的表达。添加 10nM 雌二醇后，绵羊成肌细胞的增殖速率显著提高，同时 oar-miR-485-5p 的表达水平下降，MAPK15 的表达水平上升。这表明雌激素可以通过 circFAM171A1/oar-miR-485-5p/MAPK15 通路促进绵羊成肌细胞的增殖。

在本研究中，研究人员主要运用了以下关键技术方法：一是高通量 RNA 测序技术，用于分析卵巢切除和假手术小尾寒羊背最长肌组织中的基因表达谱，从而筛选出差异表达的 circRNAs、miRNAs 和 mRNAs；二是构建 ceRNA 网络，通过生物信息学分析预测 circRNA、miRNA 和 mRNA 之间的结合位点，并利用 Cytoscape 软件构建相互作用网络，以探究基因之间的调控关系；三是细胞实验，包括细胞培养、质粒转染、免疫荧光、Western blot、CCK-8 实验等，用于验证基因功能以及它们之间的相互作用。

在研究结果部分，首先是 circRNA 表达谱分析，研究人员从 10 个肌肉测序文库中获得大量原始读数和高质量的 clean reads，共鉴定出 8721 个潜在的 circRNAs。OR-STH 组和 STH 组分别包含 2042 个和 1972 个 circRNAs，且主要类型为外显子 circRNA。

差异表达分析显示，共鉴定出 118 个差异表达的 circRNAs，其中 71 个上调，47 个下调。通过 RT-qPCR 验证，证实了 RNA 测序数据的可靠性。

ceRNA 调控网络分析方面，构建的 circRNA-miRNA-mRNA 相互作用网络表明，circFAM171A1、oar-miR-485-5p 和 MAPK15 之间存在相互调控关系，RT-qPCR 也验证了这种关系的存在。

雌激素诱导 circFAM171A1 的产生实验发现，雌激素能够显著提高 circFAM171A1 的表达水平，且在 10nM 浓度时效果最佳。

功能验证实验表明，circFAM171A1 能够促进绵羊成肌细胞的增殖，作为 oar-miR-485-5p 的海绵，减弱其对 MAPK15 表达的抑制作用，从而促进细胞增殖。

雌激素通过 circFAM171A1/oar-miR-485-5p/MAPK15 通路调控绵羊成肌细胞增殖，添加雌二醇后，细胞增殖相关蛋白和基因的表达增加，细胞增殖速率加快。

本研究揭示了雌激素诱导 circFAM171A1 表达，circFAM171A1 作为 ceRNA 调节 oar-miR-485-5p 和 MAPK15 的表达，进而调控绵羊成肌细胞增殖的分子机制。这一研究成果为深入理解雌激素在雌性动物肌肉生长发育中的作用提供了新的视角，也为后续研究哺乳动物肌肉生物学中 circRNAs 的功能奠定了基础，有助于推动相关领域的进一步发展。