工程改造酿酒酵母提升高糖发酵乙醇产量的创新突破

《Applied Microbiology and Biotechnology》：Engineered S. cerevisiae construction for high-gravity ethanol production and targeted metabolomics

研究人员针对酿酒酵母在高糖发酵中的问题，利用 CRISPR-Cas9 技术构建工程菌株，提升乙醇产量与蔗糖耐受性。

　　在生物乙醇产业的舞台上，酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）一直是备受瞩目的 “明星”。它凭借自身强大的发酵能力，将蔗糖转化为生物乙醇，在工业生产中占据着重要地位。然而，当面对高浓度蔗糖的 “挑战” 时，酿酒酵母却遭遇了重重困境。在高重力发酵环境下，高浓度的蔗糖宛如一座难以逾越的 “大山”，不仅会导致酵母细胞萎缩、活力下降，甚至还会让它们走向死亡，这极大地限制了生物乙醇的产量，也增加了生产成本。如何让酿酒酵母在高糖环境中 “茁壮成长”，提高乙醇产量，成为了科研人员亟待攻克的难题。

为了解决这一关键问题，合肥工业大学食品与生物工程学院、安徽省农产品现代加工重点实验室的研究人员勇挑重担，开展了一项极具意义的研究。他们将目光聚焦于基因编辑技术，希望借助其力量对酿酒酵母进行改造，从而提升酵母在高糖环境下的性能。

研究人员运用了当下热门且强大的基因编辑工具 —— 成簇规律间隔短回文重复序列 Cas9（CRISPR-Cas9）技术，对酿酒酵母的 7 个基因（GPD2、FPS1、ADH2、DLD3、ERG5、NTH1 和 AMS1）进行了精准敲除，成功构建出了工程菌株酿酒酵母 GFADENA。这一成果意义非凡，它为提升酿酒酵母的性能开辟了新的道路。该研究成果发表在《Applied Microbiology and Biotechnology 》上。

在这项研究中，研究人员主要运用了以下关键技术方法：一是利用 CRISPR-Cas9 技术进行基因编辑，实现对特定基因的敲除；二是通过高效液相色谱（HPLC）技术测定蔗糖、葡萄糖和乙醇的浓度；三是采用靶向代谢组学技术，深入分析能量、氨基酸和游离脂肪酸代谢，探究工程菌株的分子机制。

研究结果如下：

1. 工程菌株的构建与筛选：研究人员运用 CRISPR-Cas9 技术成功构建了酿酒酵母 GFADENA。在筛选过程中，15 个菌落出现在固体筛选培养基上，而三个对照组的平板上均无菌落生长。经过进一步对插入 DNA 的扩增和测序确认，这些真正的转化子被用于后续研究。
2. 耐受性测试：以野生型菌株为对照，酿酒酵母 GFADENA 在含有蔗糖的固体 YP 培养基上进行生长测试。结果显示，在低蔗糖浓度（100g/L）下，它与野生型菌株生长相似；但在高蔗糖浓度（200 - 400g/L）的固体培养基上，酿酒酵母 GFADENA 的生长速度明显优于野生型菌株，这表明该工程菌株在高浓度条件下获得了更高的蔗糖耐受性。
3. 发酵时间对干细胞重量的影响：根据酿酒酵母 GFADENA 的干细胞重量（DCW）与 OD 值之间的转换公式 y = 2.3045x + 0.1421（R2=0.9973），研究人员发现，在 400g/L 蔗糖的液体发酵中，酿酒酵母 GFADENA 在初始 30 小时发酵内的生长速度比野生型菌株更快。发酵 18 小时后，其干细胞重量达到 1.56g/L，是对照组（0.09g/L）的 17 倍；发酵 48 小时后，细胞产量为 3.51g/L，是野生型菌株（3.26g/L）的 1.08 倍，说明该工程菌株在高浓度蔗糖条件下具有更快的细胞增殖速率。
4. 发酵时间对蔗糖消耗和乙醇生产的影响：以 400g/L 蔗糖为发酵底物，在 96 小时的发酵过程中，酿酒酵母 GFADENA 的乙醇浓度达到 135g/L，是野生型菌株（115g/L）的 1.17 倍，且其残留蔗糖含量高于野生型菌株。发酵 72 小时后，酿酒酵母 GFADENA 中甘油浓度为 9.21g/L，仅为对照酵母（14.53g/L）的 0.63 倍。这表明酿酒酵母 GFADENA 具有更强的蔗糖消耗能力和更高的乙醇生产效率。
5. 高重力玉米糖浆发酵产乙醇：酿酒酵母 GFADENA 应用于 400g/L 玉米糖浆发酵产乙醇实验。在 96 小时的发酵过程中，发酵 66 小时时乙醇浓度达到最高，为 145g/L，糖转化为乙醇的效率为 2.2g/L/h，葡萄糖转化为乙醇的转化率达到 41.1%，占理论转化率（51.1%）的 81%。发酵 96 小时后，玉米糖浆浓度降至 10g/L，利用率高达 97%，充分展示了酿酒酵母 GFADENA 卓越的高糖耐受性和乙醇转化能力。
6. 基于靶向代谢组学的分析：通过对能量代谢的靶向代谢组学进行主成分分析（PCA），研究人员发现酿酒酵母 GFADENA 与野生型菌株之间存在显著差异。在所有代谢物中，α- 酮戊二酸（α-KG）是显著上调的代谢物之一，它作为能量供体、氨基酸生物合成前体和表观遗传调节剂，为提高工程菌株的耐受性提供了重要基础。而下调的代谢物包括一些氨基酸和糖类。此外，研究还对氨基酸代谢和游离脂肪酸代谢进行了靶向代谢组学分析，发现基因敲除导致了相关代谢物的上调和下调。

在研究结论与讨论部分，研究人员指出，酿酒酵母 GFADENA 在高浓度蔗糖条件下展现出了高耐受性，其乙醇浓度相比野生型菌株有显著提升。并且，该菌株利用 400g/L 玉米糖浆发酵时，不仅乙醇产量高，玉米糖浆的利用率也高达 97%，具备优良的高糖耐受性和转化能力。此外，多基因修饰被证实是一种基于合理设计提升预定性能的有效方法。不过，研究也存在一定的局限性，例如 CRISPR-Cas9 系统存在脱靶效应、无法改变靶序列的表观遗传状态以及对线粒体编辑机制尚不清楚等问题。尽管如此，这项研究为通过生物工程改造提高酿酒酵母乙醇产量和增强蔗糖耐受性提供了有效途径，为生物乙醇产业的发展带来了新的希望和方向，也为后续相关研究奠定了坚实的基础，激励着科研人员在该领域不断探索，进一步优化技术，克服现有困难，推动生物乙醇产业迈向新的高度。