突破绿藻蛋白纯化难题：内化亲和标签开启高值重组蛋白生产新篇

《Current Genetics》：Internalization of affinity tags enables the purification of secreted Chlamydomonas proteins

研究针对莱茵衣藻分泌蛋白亲和纯化难题，发现内化 8xHis 标签可解决，助力其成为生产平台。

　　

从微藻 “潜力股” 到蛋白生产 “实力派”：莱茵衣藻的进阶之路

在生物技术的舞台上，微藻一直是备受瞩目的 “潜力股”。它们生长迅速，凭借阳光和简单的矿物质培养基就能蓬勃生长，还能高效捕获 CO₂，土地利用效率极高，不会与耕地 “争地盘”。曾经，微藻生产生物燃料的前景让不少人满怀期待，可高昂的培养和收获成本却给这份热情泼了冷水。不过，这并未让科研人员放弃挖掘微藻的价值，将其作为生产高值产品的宿主，成为了新的探索方向。

莱茵衣藻（Chlamydomonas reinhardtii）在众多微藻中脱颖而出，成为基因工程领域的 “佼佼者”。它拥有一系列成熟的技术，如通过 CRISPR/Cas9 进行基因编辑、专用的表达菌株，还有能在短短几天内快速组装多基因构建体的 Golden Gate 基因库，转基因导入方法也十分简便。借助这些技术，科研人员成功让莱茵衣藻产出了多种高值化合物，甚至包括一些人类治疗性蛋白。

然而，在生产这些蛋白的过程中，一个棘手的问题出现了。许多人类治疗性蛋白需要糖基化修饰才能发挥作用，这就意味着它们要通过分泌途径进入培养基。理论上，培养基中蛋白成分简单，应该有利于分泌型重组蛋白的亲和纯化，但实际操作中，从莱茵衣藻培养基中纯化分泌型重组蛋白却困难重重。此前有研究报道成功纯化出带 C 端多组氨酸标签的重组蛋白，可大多只是通过免疫印迹检测到，纯化效率并不理想。研究人员在利什曼原虫（Leishmania tarentulae）中发现，C 端暴露的亲和标签常被截断，他们猜测莱茵衣藻中可能也存在类似问题，这或许就是蛋白纯化困难的 “罪魁祸首”。为了解开这个谜团，来自德国 RPTU Kaiserslautern-Landau 分子生物技术与系统生物学的研究人员展开了深入研究，相关成果发表在《Current Genetics》杂志上。

研究人员开展这项研究主要运用了以下关键技术：一是基因编辑技术，通过 CRISPR/Cas9 对莱茵衣藻进行基因编辑；二是 Golden Gate 克隆技术，用于构建含有不同 8xHis 标签位置的基因表达载体；三是 Ni-NTA 亲和层析技术，用于纯化分泌型重组蛋白；四是 SDS-PAGE、免疫染色和考马斯亮蓝染色技术，用于检测和分析蛋白。

下面来看看具体的研究结果：

1. 验证标签位置对蛋白纯化的影响：研究人员根据莱茵衣藻模块化克隆标准，构建了三种编码 8xHis 亲和标签位置不同的遗传元件。以巴西坚果富含蛋氨酸的 2S 白蛋白为测试蛋白，对其编码序列进行优化，并使用强启动子和终止子。将构建好的转录单元转化到莱茵衣藻中，筛选出表达量高的转化子。对这些转化子培养基中的蛋白进行 Ni-NTA 亲和层析，结果发现 C 端暴露 8xHis 标签的 2S 白蛋白（SP20-HA-8His）无法有效纯化，而 8xHis 标签内化的 2S 白蛋白（8His-SP20HA 和 SP20-8His-HA）则能成功纯化。
2. 评估重组 2S 白蛋白的产量和纯度：对含有 8His-SP20-HA 序列的 2S 白蛋白进行 Ni-NTA 亲和纯化，通过 SDS-PAGE 和考马斯亮蓝染色分析，发现纯化的 2S 白蛋白表观分子量比计算值大，可能是糖基化导致的。经密度测定，每升培养物可产生 31±10.9μg 重组蛋白，且杂质少，无降解产物。
3. 验证内化 8xHis 标签对其他蛋白纯化的有效性：研究人员将 SARS-CoV-2 刺突蛋白胞外域的编码序列与相关元件构建到载体中，转化莱茵衣藻后筛选出表达量高的转化子。对其培养基进行 Ni-NTA 亲和层析，结果表明，带有内化 8xHis 标签（8His-SP20-HA 序列）的刺突蛋白也能成功纯化。不过，刺突蛋白存在降解现象，每升培养物可获得 23.3±3.7μg 完整的重组刺突蛋白。

研究人员通过实验证明，内化亲和标签能够解决莱茵衣藻分泌型重组蛋白亲和纯化的难题。这一发现为将莱茵衣藻发展成为可持续生产高值重组蛋白的宿主奠定了重要基础。尽管目前重组蛋白产量较低，还面临一些挑战，但研究人员提出了多种改进策略，如优化培养条件、选择更高效的信号肽、增强内质网蛋白折叠能力等。随着这些问题的逐步解决，莱茵衣藻有望在生物技术领域大放异彩，为生产高值重组蛋白提供更加高效、可持续的平台，推动生物制药等相关产业的发展。